0226] (7)加終止液至每一微孔；
[0227] (8)取405nm的波長，加完終止液后，將ELISA板置于內在酶標儀上分別讀取每組 OD值，通過與PBS組比較，比較出洗脫液作用最適濃度及時間，具體結果參見表3。
[0228] 表3 :ELISA洗脫液最佳工作濃度計洗脫時間
[0229]
[0230] 從表3中我們可以發現，當酶：抗體=1:20時，即洗脫液中木瓜蛋白酶的濃度為 100iig/mL，各組OD值均低于其他組，說明在該濃度洗脫液洗脫效果達到最優（即將ELISA 孔壁上結合的Cr抗-酶標復合物洗脫程度達到最大，因而OD值最低）；而作用時間不管是 lh、2h、3h，各組OD值變化均不大，可見隨著時間的延長，酶活力逐漸減弱，在酶濃度不變的 情況下，延長消化時間并不能提高消化率，所以本實驗中洗脫液的作用時間為l_3h皆可。
[0231] 應用例2
[0232] 1、ELISA法檢測血漿中鉻螯合型免疫復合物
[0233] 以應用例1中確定的Clq蛋白、Cr抗體的最佳工作濃度，以及血漿最佳稀釋度，取 1〇〇份標本血衆，以方法一（即ELISA法）的方法進行檢測，具體檢測方法如下：
[0234] 1)將可以捕獲免疫復合物的蛋白包被于固相載體上：用稀釋緩沖液稀釋包被蛋 白至2500倍，加入ELISA板微孔中，37°C水浴2小時，儲存冰箱；
[0235] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入封閉液， 37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌，洗滌完成后，ELISA板于37°C放置1小 時；
[0236] 3)加待檢樣品，并且溫育：取血樣，作待檢樣品；以已知含量的鉻螯合型免疫復合 物作標準品；用稀釋緩沖液稀釋20倍，加入微孔中，37°C作用1小時；
[0237] 4)加入捕獲鉻的物質，并且溫育：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完 成后，加入用稀釋緩沖液稀釋與鉻特異性結合或能與鉻反應形成抗原抗體復合物的抗鉻抗 體稀釋至5000倍，37°C作用1小時，使其與免疫復合物上的金屬鉻反應；
[0238] 5)酶結合物溫育：移去抗Cr抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入用稀 釋緩沖液稀釋的HRP酶標抗體，37°C作用1小時，使其與抗Cr抗體反應；
[0239] 6)底物溫育：移去酶標抗體，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入底物， 37°C避光作用30分鐘；
[0240] 7)終止反應：加終止液至每一微孔；
[0241] 8)取波長為405nm，加完終止液后，將ELISA板置于內在酶標儀上分別讀取待檢樣 品OD值，具體檢測值如表4所示。
[0242] 表4 :100份標本血漿鉻螯合型免疫復合物ELISA檢測結果
[0243]
[0244] 2、ELISA+AAS法檢測血漿中鉻螯合型免疫復合物
[0245] 以應用例1中確定洗脫液最佳工作濃度以及最適洗脫時間，取100份標本血漿，利 用方法二（ELISA+AAS檢測方法）進行檢測，具體檢測方法如下：
[0246] 1)將可以捕獲免疫復合物的蛋白包被于固相載體上：用稀釋緩沖液稀釋Clq蛋白 至2500倍，加入ELISA板微孔中，4°C過夜18小時，儲存冰箱；
[0247] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加2%牛血清白 蛋白作為封閉液，37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌；洗滌完成后，ELISA 板于37°C放置1小時；
[0248] 3)加待檢樣品，并且溫育：取樣，作待檢樣品；以已知含量的鉻螯合型免疫復合物 作標準品；用稀釋緩沖液稀釋20倍，加入微孔中，37°C作用2小時；
[0249] 4)洗脫：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入木瓜蛋白酶濃 度為100yg/mL的洗脫液，37°C作用1小時；
[0250] 5)檢測：從ELISA微孔中取樣，于原子吸收光譜儀檢測螯合于免疫復合物上的鉻， 檢測值如表5所示：
[0251] 表5 :100份標本血漿鉻螯合型免疫復合物AAS檢測結果
[0252]
[0253] 3、ELISA+ICP-MS法檢測血漿中鉻螯合型免疫復合物
[0254] 以上述洗脫液最佳工作濃度以及最適工作溫度，取100份標本血清，利用方法三 的檢測方法進行檢測，具體檢測方法如下：
[0255] 1)將可以捕獲免疫復合物的蛋白包被于固相載體上：用稀釋緩沖液稀釋包被蛋 白至2500倍，加入ELISA板微孔中，37 °C水浴2小時，儲存冰箱。
[0256] 2)封閉：移去稀釋緩沖液，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入封閉液， 37°C放置1小時，移去封閉液，并用洗滌液進行洗滌。洗滌完成后，ELISA板于37°C放置1 小時；
[0257] 3)加待檢樣品，并且溫育：從循環系統取樣，作待檢樣品；以已知含量的鉻螯合型 免疫復合物作標準品；用稀釋緩沖液稀釋20倍，加入微孔中，37°C作用1小時；
[0258] 4)洗脫：移去待檢樣品，并用洗滌液進行洗滌，待洗滌完成后，加入木瓜蛋白酶濃 度為100yg/mL的洗脫液，于37°C下作用1小時；
[0259] 5)酸化：在溶液中加入酸化劑對溶液進行酸化，封口過夜，徹底酸化；
[0260] 6)檢測：加入雙氧水，并且加熱趕酸，并從上述ELISA試劑板中洗脫的溶液中取 0. 5ml液體，于電感耦合等離子體質譜儀下檢測螯合于免疫復合物上的鉻，檢測值如表6所 示：
[0261] 表6 :100份標本血漿鉻螯合型免疫復合物ICP-MS檢測結果
[0262]
[0263] 上述實施方式僅為本發明的優選實施方式，不能以此來限定本發明保護的范圍， 本領域的技術人員在本發明的基礎上所做的任何非實質性的變化及替換均屬于本發明所 要求保護的范圍。
【主權項】
1. 一種鉻螯合型免疫復合物，其特征在于，該鉻螯合型免疫復合物為以下復合物中的 一種： 鉻離子結合于免疫復合物形成的復合物，或 鉻離子結合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結合的抗體所形成的復合物；或 鉻離子結合于免疫球蛋白后與載體蛋白結合形成的復合物。2. 根據權利要求1所述的鉻螯合型免疫復合物，其特征在于，所述載體蛋白或免疫復 合物至少含有鋅指結構、巰基、半胱氨酸殘基中一種結構，鉻離子通過鋅指結構、巰基、半胱 氨酸殘基中至少一種與載體蛋白或免疫復合物結合。3. 根據權利要求2所述的鉻螯合型免疫復合物，其特征在于，所述載體蛋白為抗體蛋 白、脂蛋白、血紅蛋白、核抗原、異種血清抗原、病毒、細菌、原蟲、蠕蟲中的一種。4. 根據權利要求1所述的鉻螯合型免疫復合物，其特征在于，其中，鉻離子通過螯合劑 與載體蛋白結合后再與能和載體蛋白特異性結合的抗體結合。5. -種如權利要求1所述的鉻螯合型免疫復合物的制備方法，其特征在于，該制備方 法包括： A) 合成鉻螯合型免疫復合物的步驟； B) 提純鉻螯合型免疫復合物的步驟：采用免疫親和層析法去除步驟A)合成的鉻螯合 型免疫復合物中未參與反應的載體蛋白、特異性抗體及鉻離子。6. 根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于， 所述步驟A)具體步驟如下： (1) 配制螯合劑：將螯合劑溶于溶劑中，配制成螯合劑溶液； (2) 配制載體蛋白溶液：將載體蛋白加入到硼酸鹽溶液中，得到載體蛋白溶液； (3) 攪拌過夜：將步驟（1)的螯合劑溶液加入到步驟（2)的載體蛋白溶液中，攪拌后于 搖床中作用2-30h，得到混合液； (4) 透析袋預處理：在透析袋中加入￡0了六-似11〇)3溶液煮沸，棄廢液后用CldH2O沖洗；重 復該步驟1 _3次； (5) 透析：將步驟（3)的混合液裝入經步驟（4)處理后的透析袋中，用CldH2O透析，換水 2-3次，4°C透析過夜之后，收集液體； (6) 鉻離子螯合：在上述步驟（5)中的液體中加入HCl溶液調整pH至7. 0,緩慢加入鉻 鹽溶液，邊滴加邊振蕩，之后于搖床中作用2-30h，然后重復步驟（5) -次，收集液體，得到 鉻螯合型抗原； (7) 在上述鉻螯合型抗原中加入能與載體蛋白特異性結合的抗體反應后得到鉻螯合型 免疫復合物； 所述步驟B)具體步驟如下： (a) 將上述A)步驟合成的鉻螯合型免疫復合物復溶于生理鹽水中，得到鉻螯合型免疫 復合物溶液； (b) 層析柱預處理：使用稀釋緩沖液沖洗管路，在層析柱中裝入能與免疫復合物特異 性結合的填料，裝柱后繼續用稀釋緩沖液平衡柱子； (c) 上樣：待柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述（a)步驟得到的鉻螯合型免疫復合物 溶液，然后上柱，鉻螯合型免疫復合物吸附在填料上，未反應的載體蛋白、抗體、鉻離子隨稀 釋緩沖液流出； (d) 洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用0. 05-0. lOmol/L的Na2HPO4 溶液進行洗脫； (e) 收集：收集步驟（d)中洗脫處理后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性； (f) 將經過步驟（e)收集到的洗脫液裝入透析袋用ddH20透析除鹽，換水2-4次后，4°C 透析過夜，收集樣本； (g) 層析柱預處理：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入能與 Cr特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡柱子； (h) 上樣：待步驟（g)的柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述步驟（f)的樣本，然后將 稀釋后的樣本上柱，鉻螯合型免疫復合物吸附在填料上，未反應的抗原抗體復合物會隨稀 釋緩沖液流出； (i) 洗脫：步驟（h)之后用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用0. 5-1. Omol/L 的Na2HP04進行洗脫； (j) 收集：收集步驟（i)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性； (k) 對步驟（j)收集到的洗脫液裝入透析袋用ddH20透析除鹽，換水三次后，4°C透析過 夜，收集樣本，即得到純化的鉻螯合型免疫復合物。7. 如權利要求1所述的鉻螯合型免疫復合物在制備檢測鉻螯合型免疫復合物的酶聯 免疫試劑盒中的應用。8. -種檢測鉻螯合型免疫復合物的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，該試劑盒包括如權 利要求1所述的鉻螯合型免疫復合物的標準品。9. 根據權利要求8所述的酶聯免疫試劑盒，其特征在于，該試劑盒還包括至少一種以 下試劑：含有可捕獲抗原抗體復合物的蛋白的包被液、含有可捕獲金屬Cr的抗體包被液、 酶標抗體。10. -種定量檢測鉻螯合型免疫復合物的方法，其特征在于，以已知含量的權利要求1 所述的鉻螯合型免疫復合物作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯免疫法、 酶聯免疫與原子吸收光譜結合法、酶聯免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純免疫復 合物與原子吸收光譜結合法、提純免疫復合物與電感耦合等離子體質譜結合法、電泳與酶 聯免疫或原子吸收光譜或電感耦合等離子體質譜結合法。
【專利摘要】本發明公開了一種鉻螯合型免疫復合物及其制備方法和應用，該鉻螯合型免疫復合物為以下復合物中的一種：鉻離子結合于免疫復合物形成的復合物，或鉻離子結合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結合的抗體所形成的復合物；或鉻離子結合于免疫球蛋白后與載體蛋白結合形成的復合物。本發明所述鉻螯合型免疫復合物可用于檢測地區人群血清中是否鉻螯合型免疫復合物及含量，間接反映這個地區鉻污染程度。
【IPC分類】C07K14/00, C07K1/22, G01N33/53, C07K16/00
【公開號】CN105001310
【申請號】CN201510413049
【發明人】張積仁, 陽帆, 董欣敏, 吳婧, 蔡睿, 孫遙, 趙乙木
【申請人】上海拜豪生物科技有限公司
【公開日】2015年10月28日
【申請日】2015年7月14日