一種鉻螯合型免疫復合物及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及屬于醫學領域，具體涉及鉻螯合型免疫復合物及其制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 免疫復合物（Immunecomplexes，IC)是抗原抗體結合的產物，根據全國科學技術 名詞審定委員會的定義，是指抗體與可溶性抗原結合而形成的復合物。它分為兩類，一種是 組織中固定的免疫復合物，而另一種則是游離于血液中的免疫復合物，成為循環免疫復合 物（circulatingimmunecomplexes，CIC)。免疫復合物在清除和破壞各種抗原中起著不 可缺少的作用，機體免疫反應的結果就是不斷產生免疫復合物。當機體內抗原（或抗體） 數量略多于抗體（或抗原）時，就會形成中等分子大小的免疫復合物，它既不易被吞噬細胞 吞噬，又不能通過腎小球濾孔排出，可較長時間游離于血液和其他體液中。當血管壁通透性 增加時，此類IC可隨血液沉積在某些部位的毛細血管壁或嵌合在腎小球基底膜上，激活補 體導致免疫復合物沉積。這些沉積或鑲嵌于血管壁或組織的免疫復合物，乃造成血管基膜 炎癥和組織損傷的始動因素。免疫復合物可通過以下幾方面造成組織損傷：1)激活補體： 沉積的IC通過激活補體，產生過敏毒素和具有趨化效應的活性片段，趨化至局部的肥大細 胞、嗜堿性粒細胞釋放活性介質致局部血管通透性增高，引起滲出和局部水腫；2)吸引白 細胞浸潤和集聚：中性粒細胞在吞噬IC時釋放毒性氧化物和溶酶體酶，損傷鄰近組織；3) 活化血小板：IC可通過活化血小板釋放血管活性胺類物質，導致血管擴張、通透性增加，加 劇局部滲出和水腫，并激活凝血機制，形成微血栓，引起局部缺血、出血和組織壞死。
[0003] 多種疾病的發生都與免疫復合物的沉積息息相關，如系統性紅斑狼瘡、類風濕性 關節炎、腎病綜合征、冷球蛋白血癥、脈管炎、細菌、病毒和寄生蟲感染、過敏反應、自身免疫 疾病、皮膚病等。早在上世紀90年代，就有學者發現，在正常機體中，免疫復合物被不斷降 解，因而一般檢測不到免疫復合物或只呈現低濃度，而在上述一系列疾病中，血清中的免疫 復合物即CIC含量顯著升高。雖然CIC檢測不具有疾病特異性，但其檢測能提供關于免疫 病理、疾病的發展及預后方面的信息。在某些微生物感染、自身免疫中，檢測循環免疫復合 物可用作疾病活動性、評價機體的機能和檢測療效的指標。而近些年來，學者們致力于研究 特異性的免疫復合物，研究各種特異性免疫復合物與疾病致病、疾病發展、疾病診斷等各方 面的關系，而這些研究將促使我們對疾病有更深一步了解。
[0004] 鉻（chromium，Cr)是元素周期表VI族中的一種過渡金屬，鉻廣泛應用于電鍍、鞣 革、顏料、油漆、合金、印染等各個方面，與人們的生活息息相關，但是同樣也對人類的身體 健康產生巨大影響。在美國，Cr與Hg、Cd、Pb被稱為四大環境污染物。自然界中絡主要以 三價和六價的形式存在，而一般認為，三價鉻是人類所需的微量元素，而六價鉻才是明顯的 毒性物質。由于六價鉻易通過細胞膜進入細胞，而且可以通過一系列反應，產生強烈的細 胞毒性及基因毒性，因而普遍認為六價鉻的毒性高于三價鉻，達10 - 100倍。六價鉻進入 體內后，可以引發氧化應激、染色體畸變、細胞凋亡、多種DNA損傷（包括單鏈斷裂、DNA-蛋 白質交聯、DNA-氨基酸交聯、Cr-DNA配合物形成等），從而造成機體多處組織、器官、系統 損傷。不僅如此，六價鉻還被認為是一種強有力的致癌物，早在1990年國際癌癥研究組織(InternationalAgencyforResearchonCancer，IARC)就將六價絡作為一種人類致癌 物。關于六價鉻的細胞毒性、基因毒性、致癌性已成為當前廣泛研究的課題。
[0005] 鉻與多種蛋白質之間關系密切，可以與多種蛋白質結合，抑制多種蛋白酶的活性。 隨著對鉻毒性研究的深入，人們逐漸認識到鉻與蛋白的相互作用在其致毒過程中扮演著重 要的角色，被認為是了解鉻的毒性機理的關鍵所在，因此，對鉻和蛋白質相互作用的研究就 顯得愈發重要。而現在關于鉻與蛋白質作用的機理僅是冰山一角，還有很多蛋白質與鉻之 間的關系還不清楚，因而加強對于鉻與蛋白質之間的關系至關重要。
[0006] 2004年美國學者A. Ramanaviciene等發現血清中循環免疫復合物含量與地方環 境污染有關，發現隨著地區污染嚴重程度的增加，當地牛血清中的CIC含量顯著增加，差異 具有統計學意義，因而可以作為評價地區污染的指標。但環境污染究竟是如何刺激機體內 CIC含量顯著升高，是一種還是多種污染物共同作用導致其升高，CIC的升高是否因此會導 致機體損傷，增加機體對于疾病的易感性，這些都有待研究。眾所周知，循環免疫復合物是 一種特殊意義的蛋白質，而鉻可作用于全身多個系統的蛋白質，鉻是否可以作用于循環免 疫復合物，而使循環免疫復合物含量改變、活性改變、功能改變，這些尚缺乏相關研究。
【發明內容】
[0007] 為了克服現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種鉻螯合型免疫復合物，該 鉻螯合型免疫復合物可用于檢測地區人群血清中是否存在鉻螯合型免疫復合物及其含量， 間接反映這個地區鉻污染程度。
[0008] 為解決上述問題，本發明所采用的技術方案如下：
[0009] -種鉻螯合型免疫復合物，該鉻螯合型免疫復合物為以下復合物中的一種：
[0010] 鉻離子結合于免疫復合物形成的復合物，或
[0011] 鉻離子結合于載體蛋白及能和該載體蛋白特異性結合的抗體所形成的復合物；或
[0012] 鉻離子結合于免疫球蛋白后與載體蛋白結合形成的復合物。
[0013] 具體的，所述載體蛋白或免疫復合物至少含有鋅指結構、巰基、半胱氨酸殘基中一 種結構，鉻離子通過鋅指結構、巰基、半胱氨酸殘基中至少一種與載體蛋白或免疫復合物結 合。
[0014] 具體的，所述載體蛋白為抗體蛋白、脂蛋白、血紅蛋白、核抗原、異種血清抗原、病 毒、細菌、原蟲、蠕蟲中的一種。
[0015] 進一步的，鉻離子通過螯合劑與載體蛋白結合后再與能和載體蛋白特異性結合的 抗體結合。
[0016] 進一步的，所述螯合劑為ITCBE、EDTA、多磷酸鹽、氨基羧酸、1，3-二酮、羥基羧酸 中的一種。
[0017] 本發明還提供了兩種制備鉻螯合型免疫復合物的方法，通過這兩種方法獲得鉻螯 合型免疫復合物。
[0018] 其中，第一種制備方法包括：
[0019]A)合成鉻螯合型免疫復合物的步驟：先將螯合劑與載體蛋白結合，再與鉻離子絡 合；
[0020]B)提純鉻螯合型免疫復合物的步驟：采用免疫親和層析法去除步驟A)合成的鉻 螯合型免疫復合物中未參與反應的載體蛋白、特異性抗體及鉻離子。
[0021 ] 具體地，所述鉻螯合型免疫復合物的制備方法中，
[0022] 所述步驟A)具體步驟如下：
[0023] (1)配制螯合劑：將螯合劑溶于溶劑中，配制成螯合劑溶液；
[0024] (2)配制載體蛋白溶液：將載體蛋白加入到硼酸鹽溶液中；
[0025] (3)攪拌過夜：將步驟⑴螯合劑溶液加入到步驟⑵的載體蛋白溶液中，攪拌后 于搖床中作用2_30h，得到混合液；
[0026] (4)透析袋預處理：在透析袋中加入EDTA-NaHCO3溶液煮沸，棄廢液后用ddH20沖 洗；重復該步驟1_3次；
[0027] (5)透析：將步驟（3)的混合液裝入經步驟（4)處理后的透析袋中，用CldH2O透析， 換水2-3次，4°C透析過夜之后，收集液體；
[0028] (6)鉻離子螯合：在上述步驟（5)中的液體中加入HCl溶液調整pH至7. 0,緩慢加 入鉻鹽溶液，邊滴加邊振蕩，之后于搖床中作用2-30h，然后重復步驟（5) -次，收集液體， 得到鉻螯合型抗原；
[0029] (7)在上述鉻螯合型抗原中加入能與載體蛋白特異性結合的抗體反應后得到鉻螯 合型免疫復合物；
[0030] 所述步驟B)具體步驟如下：
[0031] (a)將上述A)步驟合成的鉻螯合型免疫復合物復溶于生理鹽水中，得到鉻螯合型 免疫復合物溶液；
[0032] (b)層析柱預處理：使用稀釋緩沖液沖洗管路，在層析柱中裝入能與免疫復合物 特異性結合的填料，裝柱后繼續用稀釋緩沖液平衡柱子；
[0033] (C)上樣：待柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述（a)步驟得到的鉻螯合型免疫復 合物溶液，然后上柱，鉻螯合型免疫復合物吸附在填料上，未反應的載體蛋白、抗體、鉻離子 隨稀釋緩沖液流出；
[0034] (d)洗脫：使用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用0. 05-0.lOmol/L的 Na2HP0j§液進行洗脫；
[0035] (e)收集：收集步驟（d)中洗脫處理后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性；
[0036] (f)將經過步驟（e)收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水2-4次后， 4 °C透析過夜，收集樣本；
[0037] (g)層析柱預處理：采用新的層析柱，用稀釋緩沖液沖洗管路，在該層析柱中裝入 能與Cr特異性結合的填料，裝柱后再用稀釋緩沖液平衡柱子；
[0038] (h)上樣：待步驟（g)的柱子平衡后，用稀釋緩沖液稀釋上述步驟（f)的樣本，然 后將稀釋后的樣本上柱，鉻螯合型免疫復合物吸附在填料上，未反應的抗原抗體復合物會 隨稀釋緩沖液流出；
[0039] ⑴洗脫：步驟（h)之后用稀釋緩沖液沖洗柱子，至基線平衡，然后使用 0? 5-1.Omol/L的Na2HPO4進行洗脫；
[0040] (j)收集：收集步驟（i)洗脫后的洗脫液，收集完畢后立即使蛋白復性；
[0041] (k)對步驟（j)收集到的洗脫液裝入透析袋用CldH2O透析除鹽，換水三次后，4°C透 析過夜，收集樣本，即得到純化的鉻螯合型免疫復合物。
[0042] 本發明還提供了上述鉻螯合型免疫復合物在制備檢測鉻螯合型免疫復合物的酶 聯免疫試劑盒中的應用。
[0043] 本發明還提供了一種檢測鉻螯合型免疫復合物的酶聯免疫試劑盒，該試劑盒包括 如權利要求1所述的鉻螯合型免疫復合物的標準品。
[0044] 進一步的，上述試劑盒還包括至少一種以下試劑：含有可捕獲抗原抗體復合物的 蛋白的包被液、含有可捕獲金屬Cr的抗體的包被液、酶標抗體。
[0045] -種定量檢測鉻螯合型免疫復合物的方法，其以已知含量的鉻螯合型免疫復合物 作為標準品，采用以下方法之一對樣品進行檢測：酶聯免疫法、酶聯免疫與原子吸收光譜結 合法、酶聯免疫與電感耦合等離子體質譜結合法、提純免疫復合物與原子吸收光譜結合法、 提純免疫復合物與電感耦合等離子體質譜結合法、電泳與酶聯免疫或原子吸收光譜或電感 耦合等離子體質譜結合法。
[0046] 相比現有技術，本發明的有益效果在于：
[0047] 1.首次合成了鉻螯合型免疫復合物，并證實了在機體內鉻可存在于免疫系統，并 證明了鉻螯合型免疫復合物的存在；
[0048] 2.本發明實現了免疫復合物的特異性識別，并實現了鉻螯合型免疫復合物的定量 檢測，提供從免疫角度檢測機體內的鉻含量水平的方法，并為工業地區的鉻污染水平提供 間接指標。
[0049] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明。
【附圖說明】
[0050] 圖1為實施例1的鉻螯合型免疫復合物通過聚丙烯酰胺凝膠介質的膠床所形成的 蛋白條帶圖；
[0051] 圖2為實施例1的鉻螯合型免疫復合物通過聚丙烯酰胺凝膠介質的膠床所形成的 蛋白條帶的X熒光分析圖；
[0052] 其中，圖1中的M為Marker，IC為鉻螯合型免疫復合物；圖2中的橫坐標為蛋白條 帶位置，縱坐標為該