>[0104] (3)4°C，14000;rpm，離屯、lOmin，吸取上層水相至一新的離屯、管中，每毫升Trizol 可吸取約0. 5~0. 55ml。
[01化](4)按每毫升最初的Trizol加入0. 5ml異丙醇，顛倒數次，混勻，室溫沉淀lOmin。
[0106] 巧)41：，1，400化口111，離屯、1〇111111，在管底可見1?歴沉淀。棄上清，每毫升最初的 Trizol加入1ml75%己醇，輕輕顛倒混勻，W清洗RNA沉淀。棄去液體。室溫倒置驚干巧~lOmin)〇
[0107] 做加入適量的50%去離子甲酯胺溶解RNA沉淀，存放于-80°C備用。
[0108] B、siRNANodhernBlot
[0109] (1)相關試劑；30%丙締酷胺（30%Acr/Bis)(配制；29g丙締酷胺，IgN，N'-亞 甲基雙丙締酷胺，加無菌水定容容至100ml，過濾除菌，避光保存）；10%過硫酸錠； N，N，N'，N' -四甲基己二胺；尿素。
[0110] 似RNA電泳
[0111] (a) 17 %聚丙締酷胺凝膠的配制
[0112]
[0113] 上述成分在50ml離屯、管中加好后混勻，用熱水加熱離屯、管使尿素充分溶解，冰上 冷卻后誘入240y1 10%APS，輕輕混勻后再加入10y1TEMED，再次混勻后倒入準備好的 膠板中，凝膠30min~1小時。
[0114] (b)RNA樣品的處理
[0115] 溶于50%去離子甲酯胺的RNA樣品于100°C變性5min，冰上放置5min。變性后的 RNA樣品加入上樣緩沖液，混勻后上樣。
[0116] (C)聚丙締酷胺凝膠電泳
[0117] 0. 5XTBE，先200V條件下電泳約30min，待樣品完全進入PAGE膠后再調高電壓至 350V，繼續電泳3. 5個小時。
[0118] (3)轉膜（轉膜緩沖液為1XTB巧
[0119] (a)將含有RNA條帶的凝膠切下，在轉膜緩沖液1XTBE中浸洗30s，同時根據凝膠 的大小準備相應大小的巧龍膜和兩份厚濾紙，同樣用轉膜緩沖液1XTBE浸濕，然后按如下 順序疊放于半干轉印槽中。從上至下依次為；厚濾紙-凝膠-巧龍膜-厚濾紙。
[0120] 化）蓋上半干轉印儀炬I0-RAD公司，型號Trans-BlotSDCE化），轉膜30~45min， 轉膜所需電流（mA)=膜的面積（cm2)X3 ;
[0121] (C)轉完后將膜放于濕潤濾紙上，紫外交聯固定，固定后的膜用保鮮膜封好置于 4°C備用。
[0122] (4)探針標記
[0123]義用Ambion公司體外轉錄標記試劑盒（MAXIscriptInvitroTranscription Kit公司，貨號AM1314)
[0124] (a)按照下表配制標記反應體系組分
[0125]
[0126] (b)混好后簡單離屯、，37°C反應1小時；
[0127] (C)降解DNA模板；加入1y1面aseI降解DNA模板，混勻，快速離心37 °C，保溫 15min。
[0128] (d)Carbonatebuffer將RNA切成約 50bp大小的片段；加入 300y1 240mM碳酸 鹽緩沖液（Carbonatebuffer),混勻，60°C反應，將探針切成20nt左右的小片段，反應時間 (min)按如下公式計算；min=[插入T載體中片段的長度化b)-0. 05]/T〇. 11X插入T載 體中片段的長度化b)X0.05];
[0129] 240mM碳酸鹽緩沖液（Carbonatebuffer)的配制；
[0130]
[0131] (e)將標記好的探針放在4°C冰箱中保存備用。
[0132] (5)雜交
[0133] 雜交緩沖液的配制；
[0134]
[01巧](a)預雜交;將雜交緩沖液倒入雜交管中40°C預熱15min后放入交聯固定的膜 40°C預雜1~2小時；
[0138] 化）雜交；將標記好的探針放入雜交管中，40°C雜交過夜；
[0139] (C)洗膜；用洗膜緩沖液2XSSC/0. 2%SDS，在50°C/15min條件下洗膜2~3次；
[0140] (d)壓片；將洗好的膜從雜交管中拿出，轉移至兩層塑膜中，檢測雜交信號強弱， 將膜放入磯屏中，根據信號強弱壓數小時或過夜；
[0141] (e)檢測雜交信號：掃描磯屏。
[0142] 結果如圖2所示，說明轉基因棉花植株可W產生SiRNA。
[0143] 實施例五轉基因棉花的抗病性檢測
[0144] 通過菌株侵染水培棉花來鑒定其抗病性。挑選飽滿的棉種用15%的次氯酸鋼浸泡 30min后，無菌水沖洗2~3遍，再用無菌水浸泡催芽過夜后平鋪在培養盒中保濕，待芽長至 3cm，種于發芽盒中。將長出子葉的苗轉移到盛滿清水的塑料盒（高8~10cm)中，于25°C， 光照16小時，黑暗8小時培養。待真葉長出時將清水換成1/3的MS培養液，每周更換一次 培養液，1片真葉展平時接種。將-8〇°C保存的大麗輪枝菌V592菌株經PDA平板活化3~ 4天，從菌落邊緣挑取菌塊放入查氏培養液，25°C，220rpm搖培5天，過濾，濾液5000g離屯、 5min，，清水稀釋抱子，血球計數板計數，將濃度調至1X107個抱子/ml。將調好濃度的抱子 懸浮液加入空塑料盒中，棉苗浸根40min后接種。之后用1/3的MS培養液25°C光照16小 時，黑暗下繼續培養棉苗8小時。每盒中種12株苗，每個品種3個重復，對照棉苗用清水 浸泡40min。20后觀察發病情況。
[0145] 計算發病率和病情指數：
[0146] 發病率=發病數/調查總數X100% (見圖6)
[0147] 病情指數=E[病級數X該級病葉（穗、株）數]/(調查總數X最高病級 數）X100(見圖7)
[0148] 發病分級標準；
[0149] 0級植物健康沒有癥狀；
[0150] 1級0.1%-25%的葉片萎黨；
[0151] 2級25%-50%的葉片萎黨；
[0152] 3級50%-75%的葉片萎黨；
[0153] 4級75%-100%的葉片萎黨或者死亡；
[0154] 野生型棉花與本實施例的轉基因棉花的發病分級標準統計圖見圖8。
[0155] 通過上述方法的結果圖，我們可W看出本實施例的轉基因棉花相比于野生型棉花 發病率、病情指數及發病分級都明顯降低，說明本實施例的轉基因棉花能夠對大麗輪枝菌 產生抗性。
【主權項】
1. 一種培育抗黃萎病的棉花的方法，其特征在于，向棉花基因組中導入SEQ ID NO. 1所 示序列的基因及其反向重復序列的基因。2. 如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法具體包括如下步驟： (1) 使用兩對引物分別擴增SEQ ID NO. 1所示序列的基因，將擴增后獲得的基因導入表 達載體，使導入后的表達載體中含有SEQ ID NO. 1所不序列的基因及其反向重復序列的基 因； (2) 通過步驟⑴中獲得的含有SEQ ID NO. 1所示序列的基因及其反向重復序列的基 因的表達載體轉化農桿菌； (3) 篩選轉化成功的農桿菌； (4) 通過步驟（3)中所述的轉化成功的農桿菌轉染棉花組織，培養轉染后的棉花組織 至棉花植株，選取產生siRNA的棉花植株培育即為抗黃萎病的棉花。3. 如權利要求2所述的方法，其特征在于，步驟（1)中所述擴增SEQ ID NO. 1所示序列 的基因使用的兩對引物序列如下： 上游引物 1 :5' 一 3' 方向：GGATCC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG ； 下游引物 1:5'一3' 方向：GAATTC GATTGCTCTGTTTGCTGGA ； 上游引物 2 :5' 一 3' 方向：GAGCTC TTCGTGTATTCGGAGTTCTG ； 下游引物 2:5'一3' 方向：AGATCT GAITGCTCTGmGCTGGA。4. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（1)中還具體包括如下步驟， 所述上游引物1及所述下游引物1以大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴增SEQ ID NO. 1所示序列的基因，將PCR產物接到pGEM-T載體，獲得載體pGEMT-VDHlil ; 使用所述上游引物2及所述下游引物2以大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴增SEQ ID NO. 1所示序列的基因，將PCR產物連接到pGEM-T載體，獲得載體pGEMT-VDHli2 ; 利用 BamHI 和 EcoRI 酶切 pGEMT-VDHlil、利用 SacI 和 BglII 酶切 pGEMT-VDHli2,回收 酶切后的片段連接到載體pSK-int，獲得載體pSK-int-RNAi ; 將載體PSK-int-RNAi用BamHI和SacI酶切，獲得SEQ ID NO. 2所示序列的基因，將 SEQ ID NO. 3所示序列的基因連接到pBI 121載體中，獲得VdHlRNAi表達載體。5. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（2)中具體通過電擊轉化的方法將所述 含有SEQ ID NO. 1所示序列的基因及其反向重復序列的基因的表達載體導入農桿菌感受態 細胞。6. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（3)中具體通過將農桿菌涂布于含有抗 生素的平板上培養篩選轉化成功的菌株。7. 如權利要求3所述的方法，其特征在于，步驟（4)中所述的棉花組織為棉花無菌苗下 胚軸。
【專利摘要】本發明涉及一種培育抗黃萎病的棉花的方法，包括向棉花基因組中導入SEQ ID NO.1所示序列的基因及其反向重復序列的基因。本發明通過在棉花植株中導入大麗輪枝菌致病基因，使棉花植株中轉錄生成與大麗輪枝菌致病基因相對應的雙鏈RNA結構，棉花植株中的Dicer-like蛋白將雙鏈RNA切割成20-25nt大小的siRNA，這些siRNA可以識別侵染棉花的大麗輪枝菌當中與之序列互補的致病基因mRNA并致其降解，降低大麗輪枝菌的致病性。
【IPC分類】A01H5/00, C12N15/11, C12N15/84
【公開號】CN104988139
【申請號】CN201510257627
【發明人】郭惠珊, 張濤
【申請人】中國科學院微生物研究所
【公開日】2015年10月21日
【申請日】2015年5月19日