培育抗黃萎病的棉花的方法
【技術領域】
[0001] 本發明總地設及生物技術領域，具體設及一種培育抗黃萎病的棉花的方法。
【背景技術】
[0002] 棉花黃萎病嚴重威脅著棉花的生產和相關產業的發展，因為黃萎病引起的棉花減 產問題非常嚴重，給棉農及國家造成了很大的經濟損失。棉花黃萎病已成為棉花生產可持 續發展的主要障礙之一，被稱為"棉花的癌癥"（簡桂良等.2003)，并已成為當前制約棉花 生產的突出問題。
[000引棉花黃萎病是由±壤絲狀真菌大麗輪枝菌（Verticillium d址liae Kleb.)所引 起的，是一種±壤傳播的維管束病害，而且病原菌變異較快，具有分布廣，危害重，存活時 間長，化學農藥難于防治等特點，是棉花生長過程中最具毀滅性的病害之一。據2012年第 11屆國際輪枝菌大會的報導，棉花2005-2010年世界平均年產量2352萬噸，因輪枝菌病害 造成的損失高達年產的30%，每1%產量的損失相當于損失3. 54億美元。
[0004] 傳統的作物抗病技術包括抗病品種的培育和施用農藥等手段，雖然棉花常規育種 在獲得抗病、農藝性狀優良新品種方面已取得了很大成就，大大促進了棉花生產，但由于育 種周期長，又難W找到高抗病性的棉花原始種質，所W僅依靠常規育種很難適應目前棉花 生產對抗病性的要求。
[0005] 近年來基因工程的快速發展使得使用生物控制各種病害蟲的方法變得可行，利用 轉基因技術培育抗性的農作物新品種，是現代農業生產利用高科技提高農作物產量、保護 生態環境、促進農業可持續發展的關鍵技術之一，早已成為國際上不爭的共識和各國重點 攻關的方向。但是，目前我國致力于棉花黃萎病抗病性的研究主要還是單一的從宿主出發， 進行分離鑒定棉花基因，離產業化育種生產還有很長的一段路。
[0006] 近年來報道的抗棉花黃萎病的轉基因植物主要有W下幾種：在擬南芥中過量 表達棉花非共生的血紅蛋白基因化化dl能夠誘導防衛反應并提高轉基因植物的抗病性 (Qu，Zhongetal. 2006);在棉花中表達桿狀病毒抗調亡基因p35和op-iap能夠增強轉基 因棉花對大麗輪枝菌的抗性（Tian,Zhangetal. 2010);在海島棉Gossypiumbarbadense 中克隆鑒定到一個抗大麗輪枝菌的基因GbVe，該基因轉入擬南芥中能使轉基因擬南芥獲得 抗性狂hang,Yangetal. 2012);在棉花中轉入一個編碼過敏致病性蛋白的基因hpaXoo能 增強植物對大麗輪枝菌的防衛反應（Miao,Wangetal. 2010);在轉基因棉花中表達植物的 抗性蛋白NaDl能增強對大麗輪枝菌及尖抱鑲刀菌的抗性（Gaspar,McKennaetal. 2014)。 除此W外，轉幾了質酶基因或者一些抗性相關基因也有報道。該些研究都是在寄主棉花中 尋找抗病基因，且大多停留在實驗室小范圍試驗階段，尚未進行大規模的田間試驗。
[0007] RNA沉默（RNA干擾）系統是一種在真核生物中廣泛存在的保守機制，其作用 方式是經一系列復雜的合成途徑產生小分子RNA并W位點特異的剪切方式使與之序列 互補的祀標RNA降解。反向重復序列、病毒復制過程或由RNA依賴的RNA聚合酶（RDR， RNA-dependentRNApolymerase)合成的長雙鏈RNA產物、或能形成莖環結構的單鏈RNA都 可能成為具有RNAeIII活性的核酸酶Dicer的底物，被Dicer剪切并產生21-24nt長度的小RNA。小RNA是RNA沉默反應的重要特征。該些小RNA分子可結合并指導包含AGO蛋白的 RISC(RNAin化cedsilencingcomplex)復合物降解與之序列同源的RNA分子，表現為小 RNA-介導的RNA沉默現象（Voinnet2001,Voinnet2002,Vaucheret2005,Brodersenand Voinnet2006,Vaucheret2006,XieandGuo2006)。小RNA主要包括微小RNA(microRNA， miRNA)和小干擾RNA(siRNA)兩種。小RNA介導的RNA沉默途徑在植物抗病方面發揮著重 要的作用。
【發明內容】
[000引本發明提供了一種培育抗黃萎病的棉花的方法，通過在棉花中導入大麗輪枝菌的 致病基因，使棉花產生siRNA，侵染棉花的大麗輪枝菌中與SiRNA同源的mRNA序列被降解， 降低大麗輪枝菌的致病性。
[0009] 本發明的一個方面，提供了一種培育抗黃萎病的棉花的方法，向棉花基因組中導 入SEQIDNO. 1所不序列的基因及其反向重復序列的基因。
[0010] 在上述技術方案中，所述方法具體包括如下步驟：
[0011] (1)使用兩對引物分別擴增SEQIDNO. 1所示序列的基因，將擴增后獲得的基因導 入表達載體，使導入后的表達載體中含有SEQIDNO. 1所示序列的基因及其反向重復序列 的基因；
[001引 似通過步驟（1)中獲得的含有SEQIDNO. 1所示序列的基因及其反向重復序列 的基因的表達載體轉化農桿菌；
[0013] (3)選取轉化成功的農桿菌；
[0014] (4)通過步驟做中所述的轉化成功的農桿菌轉染棉花組織，培養轉染后的棉花 組織至棉花植株，選取產生SiRNA的棉花植株培育即為抗黃萎病的棉花。
[0015] 在上述技術方案中，步驟（1)中所述擴增SEQIDNO. 1所示序列的基因使用的兩 對引物序列如下：
[0016]上游引物 1 ;5' 一 3' 方向；GGATCCTTCGTGTATTCGGAGTTCTG;
[0017]下游引物 1:5' 一 3'方向；GAATTCGATTGCTCTGTTTGCTGGA;
[0018] 上游引物 2 ;5, 一 3,方向；GAGCTCTTCGTGTATTCGGAGTTCTG;
[0019]下游引物 2:5' 一 3'方向；AGATCTGATTGCTCTGTTTGCTGGA。
[0020] 在上述技術方案中，步驟（1)中還具體包括如下步驟，
[0021] 所述上游引物1及所述下游引物1W大麗輪枝菌基因組DNA為模板PCR擴增SEQ IDNO. 1所示序列的基因，將PCR產物接到pGEM-T載體，獲得載體pGEMT-VDHlil;
[0022] 使用所述上游引物2及所述下游引物2W大麗輪枝菌基因組DM為模板PCR擴增 SEQIDNO. 1所示序列的基因，將PCR產物連接到pGEM-T載體，獲得載體pGEMT-VDHli2;[002引 利用BamHI和EcoRI酶切pGEMT-VDHlil、利用SacI和Bglll酶切pGEMT-VDHli2， 回收酶切后的片段連接到載體pSK-int，獲得載體pSK-int-RNAi;
[0024] 將載體PSK-int-RNAi用BamHI和SacI酶切，獲得SEQIDNO. 3所示序列的基因， 將SEQIDNO. 2所示序列的基因連接到地1121載體中，獲得V地1RNAi表達載體。
[0025] 在上述技術方案中，步驟（2)中通過電擊轉化的方法將所述含有SEQIDNO. 1所 示序列的基因及其反向重復序列的基因的表達載體導入農桿菌感受態細胞。
[0026] 在上述技術方案中，步驟（3)中具體通過將農桿菌涂布于含有抗生素的平板上培 養篩選轉化成功的菌株。
[0027] 在上述技術方案中，步驟（4)中所述的棉花組織為棉花無菌苗下胚軸。
[002引本發明通過在棉花植株中導入大麗輪枝菌致病基因，使棉花植株中轉錄生成與大 麗輪枝菌致病基因相對應的雙鏈RNA結構，棉花植株中的Dicer-like蛋白將雙鏈RNA切割 成20-25nt大小的siRNA，該些siRNA可W識別侵染棉花的大麗輪枝菌當中與之序列互補的 致病基因mRNA并致其降解，降低大麗輪枝菌的致病性。
【附圖說明】
[0029] 圖1是Southernblot的結果圖，其中，泳道1為表達載體對照，泳道2為本發明 實施例的轉基因株系；
[0030]圖 2 是No;rthe;rn blot的結果圖；
[003U 圖3是野生型棉花WC-CK的植株；
[0032] 圖4是被大麗輪枝菌V592侵染后的野生型棉花WC-CK的植株；
[0033]圖5是被大麗輪枝菌V592侵染后的本發明實施例的轉基因植株；
[0034] 圖6是本發明實施例的轉基因植株與對照野生型棉花WC-CK的植株被侵染20天 后的發病率對比圖；
[0035] 圖7是本發明實施例的轉基因植株與對照野生型棉花WC-CK的植株被侵染20天 后的病情指數對比圖；
[0036] 圖8為本發明實施例的轉基因植株與對照野生型棉花WC-CK的植株被侵染20天 后的病級數對比圖。
【具體實施方式】
[0037] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[003引下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0039] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0040] 下述實施例中的根癌農桿菌EHA105 (Eliz油ethE.Hood.NewAgrobacterium helperplasmidsforgenetransfertoplants.TransgenicResearch,July 1993,Volume2,Issue4,pp208-218)公眾可從中國科學院微生物研究所獲得。
[0041] 下述實例中的大麗輪枝菌V592 (Feng-Gao,Bang-JunZhou,AGlutamicAcid-I?ich ProteinIdentifiedinVerticiIliumdahliaefromanInsertionalMutagenesis AffectsMicrosclerotialFormationandPathogenicity.PLoSONES(12) :el5319.)公眾 可從中國科學院微生物研究所獲得。
[0042] 實施例一V的Hi表達載體的構建
[004引利用CTAB法提取大麗輪枝菌V592基因組DNA，利用W下引物W該基因組DNA為模 板，進行PCR擴增；上游引物巧'一 3'）：GGATCCTTCGTGTATTCGGAGTTCTG下游引物（下劃 線為BamHI酶切位點）（5' 一 3'）：GAATTCGATTGCTCTGTTTGCTG