dNTPs mixture 1.0 μ L，GSPl 2.5 μ L，UPM 5.0 μ L，Taq 酶 0.2 UL，稀釋的第一鏈cDNA 2. 5 yL，無菌水補至50 yL。反應程序如下：94°C預變性I min; 98°C變性10 s，72°C延伸2 min，共7個循環；98°C變性10 s，68°C延伸2 min，共33個循 環；72°C 10 min〇
[0041] 第二輪PCR以第一輪PCR反應產物50倍稀釋液作為模板，以GSP2和NUP為引物 進行擴增，反應體系如下：10 X buffer 5 μ L，dNTPs mixture 1.0 μ L，GSP2 2.5 μ L，NUP 2. 5 μ L，Taq酶0.2 μ L，稀釋模板溶液1.0 μ L，無菌水補至50 μ L，反應程序同第一輪 PCR。PCR產物用1.0% (質量體積比)的瓊脂糖凝膠電泳檢測，PCR擴增結果如圖2。凝膠回 收試劑盒(購自天根生化科技北京有限公司，以下相同）純化回收后，連接到PMD18-T載體 (購自TaKaRa公司，以下相同），轉化DH5a菌株的感受態細胞(購自大連寶生物工程有限公 司，以下相同)，轉化后的感受態均勻涂在氨芐青霉素 LB固體培養基（50 mg/L)上，培養16 小時后挑取陽性菌斑，并在氨芐青霉素 LB液體培養基（50 mg/L)中擴大繁殖，提取質粒并 經酶切驗證后測序，獲得花生4??/?因起始密碼子ATG上游轉錄區域。經測序后和基因 組步移獲得的序列比對，兩者完全同源，證明步移獲得的序列是序列。
[0042] 獲得全長序列，命名為/^是一種分離的啟動子，其系列為SEQ ID No. 1所 示的核苷酸序列或與SEQ ID No. 1實質上同源的核苷酸序列。
[0043] 實施例2 :花生Aam7植物表達載體的構建和根癌農桿菌菌株GV310U購于上海滬 尚生物科技有限公司以下相同）的轉化： 構建的重組載體是將質粒PBI121 (購自TaKaRa公司）上的35S啟動子克隆得到/^^ 片段替換而獲得。為完成此目的，首先用幻μ I /及_ I雙酶切克隆載體pMD18-/^^，同 時用命I / I酶切pBI121質粒。
[0044] 酶切反應在37°C培養箱中進行，約4-6小時之后，用1% (質量體積比)的瓊脂糖膠 電泳檢測。將克隆載體切下的小片段和pBI121 (前面已述)酶切下的大片段 用DNA凝膠回收試劑盒回收。
[0045] 按PMDIS-Z7akw酶切下的小片段和pBI121酶切下的大片段比例（150 ng小片段： 50 ng大片段）=3:1的比例（摩爾濃度比）混合樣品，加入T4 DNA連接酶5單位，10X反 應緩沖液2 yL，無菌水補充體積至20 yL，16°C過夜連接。凍融法轉化DH5a菌株的感受 態細胞，在含有卡那霉素 （50 μ g/mL)的固體LB培養基平板上篩選，挑取正常生長的菌斑 做菌落PCR，挑取陽性菌落提質粒，經酶切驗證正確的重組質粒命名為參見圖3。
[0046] 利用凍融法將ρΒΙ_/^5Λ7轉入根癌農桿菌GV3101 (購自大連寶生物生物制品有限 公司，以下相同)，用卡那霉素（50 μ g/mL)和利福平（50 μ g/mL)雙抗性平板篩選，挑斑，菌 落PCR檢測驗證，挑取陽性菌斑，保存菌株，命名為GV3101。
[0047] 其中凍融法步驟如下：（1)取0. 2 mL農桿菌GV3101感受態，于冰水中緩慢融化； (2)加入約2 yg重組質粒DNA，輕輕混勻，冰浴30 min后，投入液氮速凍lmin，然后37°C 水浴5 min，融化細胞；（3)加入800 μ L不含抗生素的YEP液體培養基，28°C輕搖培養4-5 h; (4) 12000 rpm，30s，去上清，細胞重懸于0.2 mL YEP培養基中；（5)將培養物均勻涂布 在含利福平（50 mg/L)、慶大霉素（50 mg/L)和卡那霉素（50 mg/L)的瓊脂板上，28°C培養2 天，待平板上出現轉化子后挑菌進行PCR檢測。
[0048] 實施例3 物表達載體在擬南芥中的遺傳轉化及轉基因植株篩選 參照文獻中的方法進行擬南芥轉化（ZhangX.R, et al. Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana using the floral dip method. Nature, 2006，I: 1-6)中轉化方法轉化擬南芥。操作步驟如下：待野生型擬南芥抽薹后，轉化前一 天用干凈的剪刀剪去已經發育的角果，并擴增繁殖需要轉化的農桿菌200 mL。第二天，室 溫5000轉/分鐘離心制備好的農桿菌，收集菌液，并用5%的蔗糖重新懸浮農桿菌，加入終 濃度0. 02%的Silwet L-77 ;然后將花序浸入農桿菌菌液15秒，取出后用黑色塑料袋包裹， 保濕，第二天后取下塑料袋，將轉化后的擬南芥植株重新放入培養箱，一周后進行第二次轉 化，種子成熟后收集，篩選陽性苗。
[0049] 制備含有植物表達載體的根癌農桿菌GV3101菌液，在轉化擬南芥前一 天，將pBI-Z^n GV3101轉入含有卡那霉素50 μ g/mL、利福平50 μ g/mL的LB液體培養基 200 mL中，28°C過夜培養。第二天，用紫外分光光度計（SPEK0L 1300)于276納米波長下檢 測菌液的吸光值，當菌液的吸光值達到1. 6-2. 0之間時取出。室溫（20-25 °C，以下相同）以 4000 g離心10 min，棄上清，沉淀懸浮于等體積的5%鹿糖溶液中（質量體積比)。將渾池的 蔗糖溶液倒入培養皿中，轉化前加入終濃度為0.02% (體積比）的Silwet L-77 (購自北京 五洲元業科貿中心，以下相同)，混勻。把待轉化的擬南芥整個花序輕輕的浸沒在蔗糖中，15 秒后取出植株花序，轉化后的植株用黑色塑料袋包好，放在植物生長箱中培養；第二天將塑 料袋揭開，隔一周再做一次轉化。培養一個月左右收獲種子，種子在培養箱或者日光下干燥 3-5天。將轉化收獲的TO代種子用70% (體積比）酒精和0.01% (質量比）的升汞分別消毒 3分鐘和10分鐘，然后用蒸餾水洗滌數次（5~7次)，均勻地吹打到含卡那霉素（50 mg/L) MS固體篩選培養基（MS大量元素母液100 mL ;MS微量元素母液10 mL ;MS有機母液10 mL ; MS鐵鹽10 mL ;肌醇10 mL ;蔗糖30 g ;用IM氫氧化鈉調pH至5. 8,8 g瓊脂粉，定容至1 L，高壓121°C滅菌后備用；各種母液配方見表2)表面。4°C放置3-5天，放入植物生長培養 箱(光周期16 (白天）/8 (黑暗）小時，溫度：白天22°C，暗周期20°C)培養。根據表達載體 上所特有的卡那霉素抗性篩選陽性苗。
[0050] 用干燥的濾紙吸去表面的農桿菌培養液，將侵染過的組織小心插入MS固體培養 基中（MS大量元素母液100 mL ;MS微量元素母液10 mL ;MS有機母液10 mL ;MS鐵鹽10 mL ; 肌醇10 mL ;鹿糖30 g;用IM NaOH調pH至5.8,12 g瓊脂粉，定容至I L，高壓121 °C滅菌 后備用；加入8 g瓊脂粉可配置成固體培養基。各種母液配方見表1)，26°C避光培養1天。
[0051] 葉片長到3-4葉時，取少許綠苗葉片，用SDS方法提取DNA，進行PCR陽性檢測。PCR 鑒定時所用引物： 上游引物：5' -AAATTTTGAGTATCATTTTAGTAATAG-3' ； 下游引物：5' -TTTTCGTGTTGCGTCTTC-3' ； PCR反應體系如下：基因組DNA模板I yL (約50ng)、10 X Taq酶反應緩沖液2 uL、 25 mM MgCL2 1.2 uL、2 mM dNTP 1.5 uL、10 uM 引物各 0.2 uL、0.3 單位 Taq 酶，加無菌水 至 20 yL。
[0052] 反應程序為：94°C預變性5 min，94°C變性45 s、55°C退火45 s、72°C延伸2 min，32個循環，72°C延伸5 min。用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR反應產物，結果表明 表達載體PBI-Pakw已經成功轉入擬南芥（圖4);共獲得10株陽性苗。
[0053] 表2 MS培養基母液配方
實施例4 :花生啟動子的功能分析及其應用： 本發明首次克隆得到的序列，并對其進行了功能分析。從實施例3中，擬南芥轉 化及PCR檢測步驟中篩選得到的陽性苗Tl代，自交收獲種子(即T2代)。擬南芥取T2代10 個株系的不同時期組織進行⑶S染色，花生用剪刀取不同組織進行染色。
[0054] 染色過程如下：將樣品浸泡在⑶S染液【X-gluc 0. 5 mg/mL，磷酸緩沖液50 mmol/L，鐵氛化鉀和亞鐵氛化鉀各 0. 5 mmol /T,, EDTA 10 mmol/L, Triton-χ-ΙΟΟ 0. 001%，甲 醇20% (體積