花生Δ9-硬脂酰-ACP脫氫酶AhSAD啟動子及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物基因工程和生物技術領域，具體涉及一種花生啟動子(命 名為及制備方法和應用。
【背景技術】
[0002] 植物啟動子在基因的表達調控中起著關鍵作用。基因表達調控是多種因素綜合作 用的結果。一般按照一個事件的先后順序，基因的調控分為轉錄水平調控、翻譯水平調控以 及蛋白質加工水平調控等。基因編碼的蛋白質和RNA及其次級代謝產物對于維持生物體的 整個生命活動極其重要。任何基因表達調控的錯誤都會對生命造成嚴重后果。因此，對于 基因表達調控的機理研宄一直是分子生物學研宄的熱點。轉錄水平的調控最為重要。啟動 子是轉錄水平調控的重要元件，也是基因工程表達載體的一個重要組成部分。在某種程度 上，啟動子決定了基因表達的時空順序以及表達強度。所以，研宄啟動子的功能序列對于基 因表達調控機制以及日漸成熟的植物基因工程具有非常重要的意義。
[0003] 啟動子在構建能夠高水平表達異源表達載體的過程中起到關鍵作用，它決定了外 源基因的轉錄效率和基因的表達水平。植物轉基因育種所用的啟動子可分為組成型啟動 子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子3類。組成型啟動子驅動的外源基因在轉基因植株 的所有發育時期和組織中穩定表達。對許多雙子葉植物的轉化，通常都使用含花椰菜花葉 病毒（CaMV)的35S啟動子或胭脂氨酸合成酶nos啟動子的質粒載體，而在單子葉植物轉化 中最常用的是含有水稻肌動蛋白Act啟動子，玉米泛素 Ubi啟動子及35S啟動子的質粒載 體。但是很多時候外源基因在受體植物中的持續高效表達不僅造成生物體內能源的浪費， 而且在所有組織中的表達有可能對植株本身具有毒害作用，甚至引起轉基因安全問題。因 此，組織特異性啟動子和誘導型啟動子的研宄及應用日益受到育種工作者的重視。
[0004] 在轉基因植物中鑒定的誘導型啟動子包括熱激啟動子，來源于菠菜硝酸還原酶的 誘導型啟動子等。但是誘導型啟動子的應用也具有一定限制，對受體植物進行的外在條件 處理，如熱激、激素處理等可能引起生物體內一系列的生理生化反應而不利于植株的正常 生長，而且化學調控系統中用作誘導物的甲基脫氫皮質醇（dex, dexamethasone)、雌二醇 (estradiol)和四環素（tetracycline)都對生態環境有害，不宜用于生產實踐。而使用 植物體內本身的組織特異性啟動子就可以避免這種問題。顯然，外源基因的組織特異性表 達必將有效提高轉基因作物的生物安全性。近年來在這方面已經取得很大成就，在不同組 織中特異性表達的各類啟動子已不斷得到研宄。
[0005] 花生是世界范圍內廣泛栽培的油料作物，是重要的油脂來源。花生油含有不飽和 脂肪酸以及多種營養保健成份，是許多固定消費人群的主要食用油。近年來我國花生生產 取得了長足發展，已經是世界上最大的花生生產國，但是目前中國花生油市場的供給量不 能滿足花生油的需求量，因此加強花生育種研宄，提高花生產量對國家的食用油供給安全 具有重要的現實意義。隨著轉基因技術的日益成熟，轉基因花生研宄必然在花生高產、高 抗、品質改良等方面發揮越來越重要的作用，也是實現花生高產、高抗品質改良的重要手 段。克隆并鑒定高效花生啟動子是花生轉基因研宄的重要內容。
【發明內容】
[0006] 本發明的目的：在于提供一種花生啟動子，該啟動子能夠精確定位所調控的 基因，驅動目的基因在轉基因植物的特定組織或時期表達，避免造成植物自身能源和物質 的浪費，提高外源基因在轉基因植物中的表達效率，限制其表達部位，可應用于植物的基因 工程研宄和花生的安全轉基因研宄。
[0007] 本發明的另一個目的：在于提供一種花生Pu啟動子的制備方法，該方法通過對 花生基因組進行基因組步移，獲得花生啟動子序列，方法操作簡單，結果穩定可靠。
[0008] 本發明的再一個目的：在于提供一種含有植物高效表達啟動子的重組載體，其含 有所述的啟動子核苷酸序列。該載體大小適合，在植物中易于轉化，所帶有的標記基因 表達強度高，容易檢測；通過這個載體轉化擬南芥可以獲得基因在植物中高效表達的 擬南芥轉基因植株。
[0009] 本發明還有一個目的：在于提供一種花生啟動子產n在根部、莖部、葉片、果針及 種子中的應用。花生啟動子的功能能夠反映花生因的功能，即在發育過程中 具有重要功能；在該啟動子的驅動下，目的基因主要在植株的根部、莖部、葉片、果針及種子 中精細表達。這一啟動子在植物抗病、抗倒伏、提高光合作用、含油量、抗逆等基因工程中具 有應用價值。
[0010] 為了完成上述目的，本發明采用如下技術方案： 一種分離的花生啟動子Pu，其核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。
[0011] 花生啟動子的制備方法，包括以下步驟： (1) 花生啟動子的引物序列： APl :5' - GTAATACGACTCACTATAGGGC - 3' ； GSPl :5' - CCATGCGGAACCTTGGAGATCTGAGG - 3' ； ΑΡ2 :5' - ACTATAGGGCACGCGTGGT - 3' ； GSP2 :5, - GAAGGGTTAGGGTTCAGCCTCAGAGCCAT - 3，； (2) 花生啟動子Pakw制備的步驟： 根據基因組步移試劑盒說明，取5 μ L花生的DNA，用Cra I酶切，反應體系如下：DNA 5 yL，價al 1.6yL，10Xbuffer2 yL，用無菌水補齊至20 yL，37°C過夜，用質量體積 比為1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切效果； 分別用產生平末端的限制性內切酶jral、feo/tV、A^II、和Aal在100 μ L體 系內酶切2.0-3.0 yg的基因組DNA，反應體系如下：DNA2.5 yg，限制性內切酶8 yL， IOXbuffer 10 yL，無菌水補齊至 100 yL，37°C過夜； 酶切完成后進行純化，純化步驟如下：向酶切液中加入10 UL的3M醋酸鈉和50 yL 體積比為95%的乙醇溶液，-20°C沉淀3h，然后12000 rpm離心15 min，用體積比70%的乙 醇洗絳兩遍，12000 rpm離心5 min，室溫下瞭干，用20 μ L無菌水溶解； 純化完成后加入試劑盒提供的特異性接頭Genome Walker Adaptor，反應體系如下： 10 X T4 ligase buffer 2.0 μ L，酶切處理的 DNA 8.0 μ L，T4 Iigase 1 μ L，特異性接頭 Genome Walker Adaptor 14.0 μ L，無菌水補至20 μ L，16°C過夜，將連接液用雙蒸水稀釋 10倍，保存于_20°C ;由此建立五種經限制性內切酶處理并連有特異性接頭的DNA庫； 以建立的經五種限制性內切酶處理并連有特異性接頭的DNA庫為模板，進行兩輪PCR 反應，第一輪PCR反應以GSPl和APl為引物，體系如下：10Xbuffer 5 yL，10mM的dNTPs mixture 1.0 yL，10 μΜ的 GSPl 2.5 yL，10 μΜ的API 2.5 yL，5單位/yL 的Taq 酶 0.2 yL，稀釋的DNA庫0.1 yL，無菌水補至50 yL;反應程序如下：94°C預變性lmin; 98°C變性10 s，72°C延伸2 min，共7個循環；98°C變性10 s，68°C延伸2 min，共33個循 環；72°C 10 min ; 第二輪PCR反應，以第一輪PCR反應產物的50倍稀釋液作為模板，以GSP2和AP2為引 物進行擴增，反應體系如下：l〇Xbuffer 5 yL，10mM 的 dNTPs mixture LO yL，10 μΜ 的GSP2 2.5 yL，10 μΜ的ΑΡ2 2.5 yL，5單位/yL的Taq酶0.2 yL，稀釋模板溶液 1.0 μ L，無菌水補至50 μ L，反應程序同第一輪PCR，完成后回收純化第二輪PCR產物，并 與T載體連接，經測序獲得含/^^全長序列的DNA。
[0012] 所述的花生啟動子的重組載體PBI-
[0013] 一種花生/V#重組表達載體的構建方法，包括用命/及_ I雙酶切連接有 /V#的PMD18- PBI121質粒，凝膠回收酶切下來的啟動子片段和PBI121片段，連接 轉化大腸桿菌，構建成植物表達載體
[0014] 所述的花生啟動子在根部、莖部、葉片、果針和種子中的應用。
[0015] 本發明的積極有益效果(優點）： 1、本發明提供一種花生啟動子，該啟動子能夠精確定位所調控的基因，驅動目的 基因在轉基因植物的特定組織或時期表達，避免造成植物自身能源和物質的浪費，提高外 源基因在轉基因植物中的表達效率，限制其表達部位，可應用于植物基因工程研宄和花生 的安全轉基因研宄中。
[0016] 2、本發明所提供的啟動子克隆方法克隆到的啟動子，能夠通過對基因的調控 和組化分析，獲得具有組織特異性