型炎癥的治療作用
[0043] 1.用腦心浸液培養基培養痤瘡丙酸桿菌ATCC6919,培養至對數期，生理鹽水洗滌 2次，生理鹽水重懸至5 X 108CFU/ml ;
[0044] 2.選取重量為18g的雄性小鼠，昆明種，隨機分為3組，每組9只，分別為治療組、 陽性對照組、陰性對照組，每只腹腔注射50 μ 1的氯胺酮進行麻醉，然后在小鼠左耳皮內注 射重懸后的菌液20 μ 1/只；
[0045] 3.用聚乙二醇將小分子多肽ΖΥ4、克林霉素分別配制成2mg/ml軟膏，其中聚乙二 醇與甘油的重量份比為5:1，涂擦小鼠左耳皮膚表面，治療組涂擦小分子多肽ZY4,陽性對 照組涂擦克林霉素，陰性對照組涂擦聚乙二醇，每8h -次，共給藥3次，24h后處死小鼠；
[0046] 4.用干凈的酒精棉球消毒小鼠左耳，測量小鼠耳朵厚度，結果如圖2所示：治療前 的小鼠耳朵厚度均為0. 20mm，給予2mg/ml的小分子多肽ZY4治療1天后小鼠耳朵的厚度 0. 25mm，給予2mg/ml克林霉素治療1天后小鼠耳朵厚度為0. 34mm，給予聚乙二醇治療1天 后小鼠耳朵的厚度為0.43mm,表明：ZY4消炎效果明顯好于克林霉素。
[0047] 實施例5 :小分子多肽ZY4抗肺癌腫瘤細胞A549活性實驗
[0048] 1.收集對數期肺癌腫瘤細胞A549,制成細胞懸液，調整其濃度至5 X IO6~IOX IO6個/ml，每孔加入100 μ 1，鋪板使待測細胞調密度至1000-10000孔，邊緣孔用無菌PBS填 充；
[0049] 2. 5% C02、37°C孵育，至細胞單層鋪滿96孔平地板孔底，待細胞貼壁2~12h后 加入濃度為100 μ g/ml、200 μ g/ml的小分子多肽ZY4、濃度為10 μ g/ml和5 μ g/ml的紫杉 醇，5% C02、37°C孵育16~48h，倒置顯微鏡下觀察；
[0050] 3.每孔加入20 μ I、5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，吸取孔內培養液；
[0051] 4.每孔加入150 μ 1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解， 在酶聯免疫檢測儀〇D490nm處測量各孔的吸光值，同時設置調零孔、對照孔，結果如圖3所 示：200 μ g/ml的ZY4作用于肺癌細胞A549后OD值為0. 3,100 μ g/ml的ZY4作用于肺癌 細胞A549后OD值為0. 5 ; 10 μ g/ml的紫杉醇作用于癌細胞肺癌細胞A549后OD值為0. 5， 10 μ g/ml的紫杉醇作用于癌細胞肺癌細胞A549后OD值為0. 7,表明：ZY4對肺癌腫瘤細胞 A549有明顯的抑制作用。
[0052] 實施例6 :小分子多肽ZY4抗乳腺癌細胞MDA-435活性實驗
[0053] 1.收集對數期乳腺癌細胞MDA-435制成細胞懸液，調整其濃度至5 X IO6~ IOX IO6個/ml，每孔加入100 μ 1，鋪板使待測細胞調密度至1000~10000孔，邊緣孔用無 菌PBS填充；
[0054] 2. 5% C02、37°C孵育，至細胞單層鋪滿96孔平地板孔底，待細胞貼壁2~12h后 加入濃度為50~300 μ g/ml的小分子多肽ZY4、對照為同體積的生理鹽水，5% C02、37°C孵 育16~48h，倒置顯微鏡下觀察；
[0055] 3.每孔加入20 μ l、5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，吸取孔內培養液；
[0056] 4.每孔加入150 μ 1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解，在 酶聯免疫檢測儀〇D490nm處測量各孔的吸光值，同時設置調零孔、對照孔，結果如圖4所示： 300 μ g/ml的ZY4作用乳腺癌細胞MDA-435后OD值為0. 17, 200 μ g/ml的ZY4作用乳腺癌 細胞MDA-435后OD值為0. 20,100 μ g/ml的ZY4作用乳腺癌細胞MDA-435后OD值為0. 61， 50 μ g/ml的ZY4作用乳腺癌細胞MDA-435后OD值為0. 7,表明：ZY4對乳腺癌細胞MDA-435 的抑制具有濃度依賴性。
[0057] 實施例7 :小分子多肽ZY4抗黑色素瘤細胞A357活性實驗
[0058] 1.收集對數期黑色素瘤細胞A357,制成細胞懸液，調整其濃度至5 X IO6~10 X 106個/ml，每孔加入100 μ 1，鋪板使待測細胞調密度至1000~10000孔，邊緣孔用無菌PBS填 充；
[0059] 2. 5% C02、37°C孵育，至細胞單層鋪滿96孔平地板孔底，待細胞貼壁2~12h后 加入濃度為100 μ g/ml、200 μ g/ml的小分子多肽ZY4、對照為同體積的生理鹽水，5% C02、 37°C孵育16~48h，倒置顯微鏡下觀察；
[0060] 3.每孔加入20 μ l、5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，吸取孔內培養液；
[0061] 4.每孔加入150 μ 1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解，在 酶聯免疫檢測儀〇D490nm處測量各孔的吸光值，同時設置調零孔、對照孔，結果如圖5所示： 100 μ g/ml的ZY4作用黑色素瘤細胞A357后OD值為1. 0, 200 μ g/ml的ZY4作用黑色素瘤 細胞后OD值為0. 72,生理鹽水作用黑色素瘤細胞后OD值為1. 0。表明：200 μ g/ml的ZY4 對黑色素瘤有明顯抑制作用。
[0062] 實施例8 :小分子多肽ZY4抗肝癌細胞H印G2活性實驗
[0063] 1.收集對數期肝癌細胞H印G2,制成細胞懸液，調整其濃度至5 X IO6~IOX 10 6個 /ml，每孔加入100 μ 1，鋪板使待測細胞調密度至1000~10000孔，邊緣孔用無菌PBS填充；
[0064] 2. 5% C02、37°C孵育，至細胞單層鋪滿96孔平地板孔底，待細胞貼壁2~12h后 加入濃度為100 μ g/ml、200 μ g/ml的小分子多肽ZY4、對照為同體積的生理鹽水，5% C02、 37°C孵育16~48h，倒置顯微鏡下觀察；
[0065] 3.每孔加入20 μ l、5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，吸取孔內培養液；
[0066] 4.每孔加入150 μ 1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解， 在酶聯免疫檢測儀〇D490nm處測量各孔的吸光值，同時設置調零孔、對照孔，結果如圖6所 示：100 μ g/ml的ZY4作用肝癌細胞H印G2后OD值為0. 89, 200 μ g/ml的ZY4作用肝癌細 胞H印G2后OD值為0. 6,生理鹽水作用肝癌細胞H印G2后OD值為1. 0,表明：200 μ g/ml和 100 μ g/ml的ZY4對肝癌細胞!fepG2有明顯的抑制作用。
[0067] 實施例9 :小分子多肽ZY4抗胃癌細胞SGC7901活性實驗
[0068] 1.收集對數期胃癌細胞SGC7901，制成細胞懸液，調整其濃度至5X IO6~IOXlO6個/ml，每孔加入100 μ 1，鋪板使待測細胞調密度至1000~10000孔，邊緣孔用無菌PBS填 充；
[0069] 2. 5% C02、37°C孵育，至細胞單層鋪滿96孔平地板孔底，待細胞貼壁2~12h后 加入濃度為50~300 μ g/ml的小分子多肽ZY4、對照為同體積的生理鹽水，5% C02、37°C孵 育16~48h，倒置顯微鏡下觀察；
[0070] 3.每孔加入20 μ l、5mg/ml的MTT溶液，繼續培養4h，吸取孔內培養液；
[0071] 4.每孔加入150 μ 1二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩lOmin，使結晶物充分溶解，在 酶聯免疫檢測儀〇D490nm處測量各孔的吸光值，同時設置調零孔、對照孔，結果如圖7所示： 50 μ g/ml的ZY4作用胃癌細胞SGC7901后OD值為0. 65,100 μ g/ml的ZY4作用胃癌細胞 SGC7901 后 OD 值為(λ 57, 200 μ g/ml 的 ZY4 作用胃癌細胞 SGC7901 后 OD 值為(λ 2, 300 μ g/ ml的ZY4作用胃癌細胞SGC7901后OD值為0. 09,表明：ZY4對肝癌細胞胃癌細胞SGC7901 有明顯的抑制作用。
【主權項】
1. 小分子多肽ZY4,其特征在于，它包含17個氨基酸殘基，分子量為2374. O Da，等電 點為10. 74,其氨基酸序列如SEQ ID: 1所示，為纈氨酸-半胱氨酸-賴氨酸-精氨酸-色氨 酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色 氨酸-半胱氨酸-纈氨酰胺，所述基因序列中兩個半胱氨酸形成一個分子內二硫鍵。2. -種如權利要求1所述小分子多肽ZY4在制備抗感染藥物中的應用。3. -種如權利要求1所述小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡藥物和化妝品中的應用。4. 一種如權利要求1所述小分子多肽ZY4在制備抗腫瘤藥物中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感染、抗腫瘤藥物及化妝品中的應用。它包含17個氨基酸殘基，分子量為2374.0 Da，等電點為10.74，其氨基酸序列如SEQ ID:1所示。本發明中的多肽ZY4為人工合成，具有分子量小、人工合成方便的優點，本發明的多肽ZY4通過實驗證明抑菌效果明顯，對痤瘡具有顯著的治療效果；該多肽還能抑制腫瘤細胞的生長，對腫瘤細胞具有殺傷作用；小分子多肽ZY4能夠在制備抗感染、抗腫瘤和治療痤瘡藥物及化妝品中應用。
【IPC分類】C07K7/08, A61P17/10, A61P31/04, A61P35/00
【公開號】CN104974228
【申請號】CN201510331263
【發明人】賴仞, 容明強, 杜彥軍
【申請人】四川合泰新光生物科技有限公司, 中國科學院昆明動物研究所
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年6月15日