一種小分子多肽zy4及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感 染抗腫瘤藥物及化妝品中的應用。
【背景技術】
[0002] 痤瘡是一種毛囊性皮脂腺的慢性炎癥，是青少年時期常見的炎性皮膚病，好發生 于面頰、額部、頰部和鼻唇溝，其次是胸部、背部和肩部，其發病主要與性激素水平、皮脂腺 大量分泌、痤瘡丙酸桿菌增殖、毛囊皮脂腺導管的角化異常及炎癥等因素相關。青春期的皮 膚表面脂質成分有所改變，雄性激素增多，造成皮脂毛囊導管角化過度，毛囊壁上脫落的上 皮細胞與皮脂混合，栓塞在毛囊口內，形成粉刺，再受丙酸菌等作用，加上細菌感染，引起炎 癥，產生膿瘡，患后異常痛苦。
[0003] 腫瘤是機體在各種致癌因素作用下，局部組織的某一個細胞在基因水平上失去對 其生長的正常調控，導致其克隆性異常增生而形成的新生物。根據腫瘤對人體危害的大小 及其生長特性而分為良性腫瘤和惡性腫瘤兩類。惡性腫瘤生長迅速，生長時常向周圍組織 浸潤，表面幾無包膜，常有全身轉移。目前，惡性腫瘤的發病率有逐年升高的趨勢，在各種疾 病的死亡原因中也占前幾位，因而是重點防治的一種疾病。
[0004] 抗菌肽是生物體內經誘導產生的一種具有生物活性的小分子多肽，分子量在 1000~7000左右，由10~60個氨基酸殘基組成。抗菌肽是當生物受到微生物侵入后機 體迅速產生的高效、光譜的抗菌肽類分子，來參與機體的免疫反應。抗菌肽作為機體有效 的防御分子是廣泛存在的，目前已從微生物、植物、昆蟲、節肢動物、兩棲動物、哺乳動物甚 至人體內鑒定出上千種抗菌肽。抗菌肽抗菌機理復雜，但大多數理論都認為其機制涉及到 抗菌肽的陽離子性和疏水性與帶負電荷的微生物胞膜的作用，抗菌肽和細菌的細胞膜接觸 后，引起膜通透性改變，或在細菌細胞膜上形成跨膜的孔洞，最后導致細菌內容物外泄而 死亡。因此，抗菌肽在殺滅細菌的速度上要遠遠高于傳統的抗生素，且不像抗生素在低濃 度下抑制細菌的生長，抗菌肽對細菌的作用幾乎都是致死性的。研宄表明：抗菌肽與傳統 抗生素相比，不易誘導耐藥菌株的產生；抗菌譜光，對細菌、真菌、病毒、原蟲及癌細胞均有 作用。已經在家禽體內發現了 3個家族的抗菌肽，包括cathelicidin，liver-expressed antimicrobial peptide (LEAP)，and β-defensin。這些抗菌肽對于家禽抵抗細菌性、病 毒性疾病具有至關重要的作用，相關這些基因的突變或者缺失對于家禽抗微生物感染的 能力將有顯著的影響；這些抗菌肽除了具有光譜抗菌活性，同時還有高效的抗真菌、抗病 毒、抗原蟲和（或）抗腫瘤活性，如Bat5和Mc7能殺滅鉤端螺旋體，對白色念珠菌、隱球 菌和胞膜病毒和寄生蟲都有較好的殺滅作用；一些抗菌肽對皰瘆病毒、流感病毒、艾滋病 病毒有囊膜病毒有明顯的殺傷力；此外，有些抗菌肽同時還具有多種其他的調控功能，如 Cathelicidin還具有促進傷口愈合、組織損傷修復、化學趨化作用、促血管生成和抗寄生蟲 等功能，在調節動物機體免疫上有著重要生物學活性。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于克服現有技術的缺點，提供一種小分子多肽ZY4 ;
[0006] 本發明的另一個目的在于提供一種小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感染、抗 腫瘤藥物及化妝品中的應用。
[0007] 本發明的目的通過以下技術方案來實現：小分子多肽ZY4,它包含17個氨基酸殘 基，分子量為2374. ODa，等電點為10. 74,其氨基酸序列如SEQ ID: 1所示，為纈氨酸-半胱氨 酸-賴氨酸-精氨酸-色氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-賴氨酸-精氨酸-賴氨酸-色 氨酸-賴氨酸-賴氨酸-色氨酸-半胱氨酸-繳氨酰胺（ValCysLysArgTrpLysLysTrpLys ArgLysTrpLysLysTrpCysVal-NH2)，所述基因序列中兩個半胱氨酸形成一個分子內二硫鍵， C-末端的Val酰胺化。
[0008] 本發明的小分子多肽ZY4在制備治療痤瘡、抗感染、抗腫瘤藥物及化妝品中的應 用。
[0009] 本發明的有益效果是：本發明中的多肽ZY4為人工合成，具有分子量小、人工合成 方便的優點，本發明的多肽ZY4通過實驗證明抑菌效果明顯，對痤瘡具有顯著的治療效果； 該多肽還能抑制腫瘤細胞的生長，對腫瘤細胞具有殺傷作用；小分子多肽ZY4能夠在制備 抗感染、抗腫瘤和治療痤瘡藥物及化妝品中應用。
【附圖說明】
[0010] 圖1為小分子多肽ZY4對小鼠耳痤瘡模型的治療作用示意圖。
[0011] 圖2為小分子多肽ZY4對小鼠耳痤瘡模型炎癥的治療作用示意圖。
[0012] 圖3為小分子多肽ZY4抗肺癌細胞A549活性的示意圖。
[0013] 圖4為小分子多肽ZY4抗乳腺癌細胞MDA-435活性的示意圖。
[0014] 圖5為小分子多肽ZY4抗黑色素瘤細胞A357活性的示意圖。
[0015] 圖6為小分子多肽ZY4抗肝癌細胞HepG2活性的示意圖。
[0016] 圖7為小分子多肽ZY4抗胃癌細胞SGC7901活性的示意圖。
【具體實施方式】
[0017] 下面結合附圖和實施例對本發明做進一步的描述，本發明的保護范圍不局限于以 下所述：
[0018] 實施例1 :小分子多肽ZY4的制備
[0019] 1.稱取樹脂0.2g放置于干燥潔凈的反應管中，加入適量的N，N-二甲基酰胺 (DMF)，活化30min。稱取第一氨基酸殘基lmmol，4-二甲氨基吡啶（DMAP) 150mg加入到反應 管中，DMF做為溶劑反應3h，反應完畢后用DMF洗3-6次，加入適當的吡啶和乙酸酐，體積比 為1: 1，反應30min，反應完畢后DMF洗3-6次。然后用哌啶洗脫氨基酸的保護基團Fmoc，洗 脫兩次，每次15min，再用DMF洗4次，甲醇洗2次；
[0020] 2.稱第二個氨基酸3mmol，HBTU 3_〇1于反應管中，加入DIEA 0· 5ml，反應40min， 用DMF洗3-6次，加入哌啶溶液兩次洗脫氨基酸的保護基團Fmoc，每次lOmin，再用DMF洗 4次，甲醇洗2次；
[0021] 3.重復第二個步驟直到最后一個氨基酸殘基；
[0022] 4.最后一個氨基酸反應完畢后，用三氟乙酸切割2h，反應抽濾，得到多肽的三氟 乙酸溶液，用乙醚沉淀，離心，再用乙醚洗3-5遍，得到白色固體，經過HPLC脫鹽凍干得到多 肽樣本。
[0023] 實施例2 :小分子多肽ZY4抗菌實驗
[0024] 1.分別制備大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶血性葡萄 球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌菌液，37°C恒溫培養18h，備用；
[0025] 2.配制濃度為0· 8~20 μ g/ml小分子多肽ZY4溶液，將直徑為5~7mm的圓形定 性濾片消毒烘干后浸入上述不同濃度的小分子多肽ZY4溶液中；
[0026] 3.制備高柱肉湯瓊脂培養基，滅菌，備用；
[0027] 4.溶化高柱肉湯瓊脂培養基，冷卻至50°C，分別加入大腸桿菌、白色念珠菌、金黃 色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌菌液lml，輕搖 均勻，倒入無菌平皿，輕晃使培養基均勻平鋪在平皿上；
[0028] 5.用消毒過的鑷子將濾片整齊、有序的放入冷卻的平皿內，蓋上陶瓦蓋，并做標 記，置于37°C恒溫培養箱內培養24h ;
[0029] 6.用卡尺測量抑菌圈大小，并比較不同濃度小分子多肽ZY4對不同細菌的作用強 度，結果如表1、表2。
[0030] 表 1 :
[0031]
[0032] 如表1所不：小分子多肽ZY4對大腸桿菌、白色念珠菌、金黃色葡萄球菌和枯草芽 孢桿菌的最低抑菌濃度分別為 12. 15 μ g/ml、2. 12 μ g/ml、2. 14 μ g/ml、l. 10 μ g/ml。
[0033] 表 2 :
[0034]
[0035] 如表2所示：小分子多肽ZY4對痤瘡有關的金黃色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表 皮葡萄球菌、科氏葡萄球菌的最低抑菌濃度分別為2. 25 μ g/ml、2. 17 μ g/ml、2. 45 μ g/ml、 I. 10 μ g/ml。實驗結果表明：小分子多肽ZY4具有顯著的抑菌作用。
[0036] 實施例3 :小分子多肽ZY4對小鼠耳痤瘡模型的治療作用
[0037] 1.用腦心浸液培養基培養痤瘡丙酸桿菌ATCC11817,培養至對數期，生理鹽水洗 滌2次，生理鹽水重懸至5 X 108CFU/ml ;
[0038] 2.選取重量為18g的雄性小鼠，昆明種，隨機分為3組，每組6只，分別為治療組、 陽性對照組、陰性對照組，每只腹腔注射120 μ 1、1 %的戊巴比妥鈉進行麻醉，然后在小鼠左 耳皮內注射重懸后的菌液20 μ 1/只；
[0039] 3.用聚乙二醇、甘油將小分子多肽ΖΥ4、克林霉素分別配制成2mg/ml軟膏，其中聚 乙二醇與甘油的重量份比為5:1，涂擦小鼠左耳皮膚表面，治療組涂擦小分子多肽ZY4,陽 性對照組涂擦克林霉素，陰性對照組涂擦聚乙二醇，每8h -次，共給藥3次，24h后處死小 鼠；
[0040] 4.用干凈的酒精棉球消毒小鼠左耳，剪下左耳并剪碎，轉移至勻漿器中充分勻漿， 1只耳朵加入1ml生理鹽水勻漿；
[0041] 5.稀釋勻漿液至1000倍，取50 μ 1稀釋液涂腦心浸液培養基平板，37°C厭氧培養 72h，計數菌落。結果如圖1所示：給予2mg/ml的小分子多肽ZY4治療后痤瘡丙酸桿菌的菌 落數為2. IX 105,給予2mg/ml克林霉素治療后痤瘡丙酸桿菌的菌落數為5. 6 X 105,給予聚 乙二醇治療后痤瘡丙酸桿菌的菌落數為9. 44X 105,表明：ZY4對小鼠耳痤瘡治療效果明顯 好于克林霉素。
[0042] 實施例4 :小分子多肽ZY4對小鼠耳痤瘡模