CAGGTCTCTCTCGTTTGTTACATCG-3' ) (SEQ ID NO. 10),以百子蓮 cDNA 為模板進行 PCR,擴增 得到549bp百子蓮Aux/IAA3蛋白的全長編碼序列(SEQ ID NO. 3)。
[0058] 實施例2、百子蓮Aux/IAA3基閔的序列信息與同源件分析
[0059] 本發明新的百子蓮Aux/IAA3基因全長開放讀碼框序列為549bp,詳細序列見SEQ ID NO. 3所示序列。根據開放讀碼框序列推導出百子蓮Aux/IAA3蛋白的氨基酸序列,共182 個氨基酸殘基,分子量為20. 73kDa,等電點(pi)為6. 44,詳細序列見SEQ ID NO. 4所示序 列;
[0060] 將百子蓮AUX/IAA3的開放讀碼框序列及其編碼蛋白的氨基酸序列用BLAST程序 在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translations +PDB+SwissProt+Superdate+PIR數據庫中進行核苷酸和蛋白質同源性檢索,結果發現它與 蓖麻Aux/IAA13基因(登錄號:XM_002526495. 1)在核苷酸水平上具有83%的相同性,如圖 1所示(Query :百子蓮Aux/IAA3的編碼基因序列;Sbjct :蓖麻Aux/IAA13的mRNA序列); 在氨基酸水平上,它與小果野芭蕉Aux/IAA9基因(登錄號:XP_009419087. 1)也有45%的 一致性和58%的相似性,如圖2所示(Query :百子蓮Aux/IAA3蛋白的氨基酸序列;Sbjct : 小果野芭蕉Aux/IAA9蛋白的氨基酸序列)。由此可見,百子蓮Aux/IAA3基因與其它已知物 種的Aux/IAA基因無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。
[0061] 實施例3、百子蓮Aux/IAA3基閔轉化樽式棺物擬南芥
[0062] L含目的基因(百子蓮Aux/IAA3基因)的表達載體的構建
[0063] 根據百子蓮Aux/IAA3基因全長編碼序列(SEQ ID NO. 3),設計擴增在完整編碼閱 讀框的引物,并在上下游引物上分別引入限制性內切酶位點(這可視選用的載體而定),以 便構建表達載體。以實施例1中獲得的擴增產物為模板,經PCR擴增后,將百子蓮Aux/IAA3 基因的編碼區序列連接至中間載體(如PMD19-T)中進行測序,再將測序正確的百子蓮Aux/ IAA3基因的編碼區序列進一步克隆到表達載體中(如pHB),在鑒定好閱讀框正確的前提下 將其轉入根癌農桿菌中(如GV3101),并對轉化后的農桿菌進行PCR鑒定,以保證含有百子 蓮Aux/IAA3基因的植物表達載體成功轉化入根癌農桿菌中。
[0064] 2.根癌農桿菌介導轉化擬南芥
[0065] (1)預搖農桿菌:挑陽性單克隆至25ml含50mg/L Kan、50mg/L慶大霉素、25mg/L Rif的YEP液體培養基中,28°C,200rpm搖菌24h ;
[0066] (2)擴培農桿菌:將預搖的農桿菌菌液以I : 100擴培至含400mL Kan抗性YEP培 養基中,28°C,200rpm,培養13-16h,培養至吸光度0D600達到1. 5-2. 0之間收菌,收菌條件 是 23°C,5000rpm,8min ;
[0067] (3)轉化植株:(需要在轉化前一天或是轉化當天剪去植株上所有的角果和盛開 以及露白的小花)配制500mL含5%蔗糖的1/2MS溶液,用少量MS溶液將收集的農桿菌沉 淀懸起,搖勻,向剩余的蔗糖溶液中加入〇. 04% (v/v)的Silwet L-77與10 μ L6-BA(母液 為lmg/mL),攪勻,在轉化前將二者混勻,將植株莖部及花序浸泡在菌液中50s,取出瀝干菌 液,放入一次性塑料袋中,密封保濕。將所有植株轉化完畢后,罩上黑盒子,避光培養24h。 之后取出植株,將植株直立放置,澆水培養,保證植株水分充足。
[0068] 3.轉基因陽性株系的篩選
[0069] 轉化后的植株待角果全部成熟后收種子,在墊有濾紙的干燥培養皿中室溫放置一 周,使種子全部干燥,之后用50目的不銹鋼篩過濾種子,除去角果,收集轉基因 TO代種子并 播種于穴盤中,用〇. 05% (v/v)草甘膦進行幼苗抗性篩選,獲得Tl代轉基因植株,持續篩選 直至獲得T3代純合體轉基因植株。野生型與Aux/IAA3轉基因擬南芥植株的表型具有顯著 性差異(圖3) ;Aux/IAA3轉基因植物生長明顯緩慢與野生型植株,說明Aux/IAA3對生長素 具有負調控作用。
[0070] 4.轉基因擬南芥植株AUX/IAA3基因表達差異
[0071] 剪切擬南芥野生型與Aux/IAA3轉基因植株的葉片0. 2g,提取RNA、制 備cDNA并進行實時定量PCR分析。Real-time PCR中Aux/IAA3基因定量分析的 特異性引物為qAUX/IAA3F(5 ' -CAATAACCATATCGCCTATCC-3 ' )(SEQ ID N0.11), 引物 qAUX/IAA3R(5 ' -ATCGTCCTCCTTGTCATC-3 ' ) (SEQ ID NO. 12),內參基因為擬 南芥 UBQ5 基因,引物為 UBQ5-F(5 ' -GACGCTTCATCTCGTCC-3 ' ) (SEQ ID NO. 13), UBQ5-R(5' -CCACAGGTTGCGTTAG-3' )(SEQ ID N0.14)。采用 r^ct法作相對定量分析,結 果表明轉基因擬南芥中Aux/IAA3的表達量較高,是內參基因
[0072] UBQ5的3. 2倍,是野生型植物的5738倍(圖4)。表明Aux/IAA3沒有在野生型植 株中表達。
[0073] 以上對本發明的具體實施例進行了描述。需要理解的是,本發明并不局限于上述 特定實施方式,本領域技術人員可以在權利要求的范圍內做出各種變形或修改,這并不影 響本發明的實質內容。
【主權項】
1. 一種如下(a)或(b)的蛋白質: (a) 由如SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質; (b) SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有 百子蓮Aux/IAA3蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質。2. 如權利要求1所述的蛋白質,其特征是,所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序 列經過1~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代,或者在C末端和/或N末端添加1~20 個以內氨基酸而得到的序列。3. 如權利要求2所述的蛋白質,其特征是,所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列 中1~10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。4. 一種編碼權利要求1所述蛋白質的核酸序列。5. 如權利要求4所述的核酸序列,其特征是,所述核酸序列具體為: (a)堿基序列如SEQ ID NO. 3第1~549位所示; 或(b)與SEQ ID NO. 3第1~549位所示的核酸有至少70%的同源性的序列; 或(c)能與SEQ ID NO. 3第1~549位所示的核酸進行雜交的序列。6. 如權利要求4所述的核酸序列,其特征是,所述核酸序列具體為SEQ ID N0.3第1~ 549位所示的核酸序列中1~90個核苷酸的缺失、插入和/或取代,或者在5'和/或3' 端添加60個以內核苷酸形成的序列。7. -種用于檢測如權利要求4所述核酸序列的探針,其特征在于,所述探針為包含有 所述核酸序列8~100個連續核苷酸的核酸分子。
【專利摘要】本發明公開了一種百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3及其編碼基因和探針,所述蛋白質為如下(a)或(b)的蛋白質:(a)由如SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列組成的蛋白質;(b)SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列經過取代、缺失或者添加一個或幾個氨基酸且具有百子蓮Aux/IAA3蛋白活性的由(a)衍生的蛋白質。本發明還提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列,以及檢測上述核酸序列的探針;本發明為利用基因工程技術調控百子蓮生長素信號轉導途徑,從而達到控制其生長發育、器官形態建成的目的,為分子育種提供了理論依據,具有很大的應用價值。
【IPC分類】C07K14/415, C12Q1/68, C12N15/11, C12N15/29
【公開號】CN104961814
【申請號】CN201510359293
【發明人】張荻, 陳冠群, 王俊杰, 申曉輝
【申請人】上海交通大學
【公開日】2015年10月7日
【申請日】2015年6月25日