百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3及其編碼基因和探針的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白及其編碼基因和探針，具體涉及一種 百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3及其編碼基因和探針。
【背景技術】
[0002] 內源激素對觀賞植物生長發育及觀賞性狀調控具有重要的作用，生長素在植物體 內是唯一一種具有極性運輸特征的內源激素。生長素的含量與分布關系到植株的生長與發 育速度及各器官組織的極性結構與空間形態。生長素的信號傳導途徑目前研宄的較為清 楚，其中Aux/IAA是重要的生長素轉錄抑制因子，當它與生長素結合時會抑制生長素的轉 錄，降低生長素含量。
[0003] 體細胞胚胎發生（體胚）是植物分子育種與離體快繁最有效的技術體系，已有研 宄表明植物體胚誘導主要依賴于外源生長素調控，且外源生長素類物質毒莠定對單子葉球 根花丼體胚誘導具特效性。百子蓮為熱帶多年生花丼，花量大、花期長、觀賞價值高，具有地 下塊莖組織。我們前期建立的百子蓮體胚體系表明生長素信號對百子蓮體胚誘導、體胚形 態、體胚數量與體胚成苗具有決定性作用。另外，應用外源調控物質打斷生長素極性運輸對 百子蓮花期、植株矮化、花序形態均有明顯的調控作用。因此，生長素信號對花丼產業化生 產與育種改良工作具有至關重要的作用。
[0004] Aux/IAA的編碼基因已從多種植物中克隆出來，包括：擬南芥、水稻、玉米、葡萄、 蓖麻等。但對于觀賞植物，尤其是球根花丼中，Aux/IAA的克隆、表達模式及蛋白序列尚不 清楚。目前，未有任何與百子蓮Aux/IAA3蛋白及其編碼基因序列相關的文獻報道。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于填補百子蓮AUX/IAA3基因的克隆、表達模式分析以及百子蓮 Aux/IAA3蛋白的空白，提供了一種百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3,本發明還提 供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列以及檢測所述核酸序列的探針；本發明公開了百子 蓮Aux/IAA3基因轉化擬南芥后的生理效應及表達模式，為今后利用基因工程技術對Aux/ IAA3基因表達的時空特性進行調控，從而為體胚發生、株型調控提供了理論依據，具有很大 的應用價值。
[0006] 第一方面，本發明提供了百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白，所述蛋白質是由如SEQ IDNO. 4所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或由SEQ IDNO. 4所示的氨基酸序列經過取代、缺 失或者添加一個或幾個氨基酸且具有百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白特征的蛋白質。
[0007] 優選的，所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列經過1~50個氨基酸的缺失、 插入和/或取代，或者在C末端和/或N末端添加1~20個以內氨基酸而得到的序列。
[0008] 進一步優選的，所述蛋白質為SEQ ID NO. 4所示氨基酸序列中1~10個氨基酸被 性質相似或相近的氨基酸所替換而形成的序列。
[0009] 第二方面，本發明提供了一種編碼上述蛋白質的核酸序列。
[0010] 優選的，所述核酸序列具體為：(a)堿基序列如SEQ ID NO. 3第1~549位所示； 或（b)與SEQ ID NO. 3第1~549位所示的核酸有至少70%的同源性的序列；或（c)能與 SEQ ID NO. 3第1~549位所示的核酸進行雜交的序列。
[0011] 優選的，所述核酸序列具體為SEQ ID NO. 3第1~549位所示的核酸序列中1~ 90個核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在Y和/或:V端添加60個以內核苷酸形成的 序列。
[0012] 第三方面，本發明還提供了一種檢測上述核酸序列的探針，所述探針為具有上述 核酸序列8~100個連續核苷酸的核酸分子，該探針可用于檢測樣品中是否存在編碼百子 蓮Aux/IAA3相關的核酸分子。
[0013] 在本發明中，"分離的DNA"、"純化的DNA"是指，該DNA或片段已從天然狀態下位 于其兩側的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經與天然狀態下伴隨核酸的組分分開， 而且已經與在細胞中相伴隨的蛋白質分開。
[0014] 在本發明中，術語"百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3蛋白編碼序列"指 編碼具有百子蓮Aux/IAA3蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 3所示的第1~549 位核苷酸序列及其簡并序列。該簡并序列是指，位于SEQ ID NO. 3所示的第1~549位核苷 酸中，有一個或多個密碼子被編碼相同氨基酸的簡并密碼子所取代后而產生的序列。由于 密碼子的簡并性，所以與SEQ ID NO. 3所示的第1~549位核苷酸序列同源性低至約70% 的簡并序列也能編碼出SEQ ID NO. 4所示的序列。該術語還包括與SEQ ID NO. 3所示的核 苷酸序列的同源性至少70 %的核苷酸序列。
[0015] 該術語還包括能編碼天然百子蓮Aux/IAA3蛋白的相同功能、SEQ ID NO. 3所示序 列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）：通常為1~90個核苷酸的缺失、插入 和/或取代，以及在Y和/或:V端添加為60個以內核苷酸。
[0016] 在本發明中，術語"百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3"指具有百子蓮 Aux/IAA3蛋白活性的SEQ ID NO. 4所示序列的多肽。該術語還包括具有與天然百子蓮Aux/ IAA3蛋白相同功能的、SEQ ID NO. 4序列的變異形式。這些變異形式包括（但并不限于）： 通常為1~50個氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或 為20個以內氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會 改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數個氨基酸通常也不會改 變蛋白質的功能。該術語還包括百子蓮Aux/IAA3蛋白的活性片段和活性衍生物。
[0017] 本發明的百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3的變異形式包括：同源序列、 保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與百子蓮 Aux/IAA3相關DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用百子蓮Aux/IAA3蛋白的抗血清獲得 的多肽或蛋白。
[0018] 在本發明中，"百子蓮Aux/IAA3保守性變異多肽"指與SEQ ID NO. 4所示的氨基酸 序列相比，有至多10個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性 變異多肽最好根據表1進行替換而產生。
[0019] 表 1
[0020]
[0021] 發明還包括百子蓮Aux/IAA3蛋白或多肽的類似物。這些類似物與百子蓮Aux/ IAA3相關多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差 異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技 術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分 子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基（如D-氨基酸）的類似 物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸（如β、γ-氨基酸）的類似物。應理解，本發 明的多肽并不限于上述列舉的代表性的多肽。
[0022] 修飾（通常不改變一級結構）形式包括：體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙 酰化或羧基化。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進 行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶（如哺乳動 物的糖基化酶或去糖基化酶）而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基（如磷酸酪 氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸）的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優 化了溶解性能的多肽。
[0023] 利用本發明的百子蓮生長素信號轉錄調控蛋白Aux/IAA3,通過各種常規篩選方 法，可篩選出與百子蓮Aux/IAA3蛋白相關發生相互作用的物質，或抑制劑與拮抗劑等。
[0024] 本發明檢測樣品中是否存在百子蓮Aux/IAA3相關核苷酸序列的檢測方法，包括 用上述的探針與樣品進行雜交，然后檢測探針是否發生了結合。該樣品是PCR擴增后的產 物，其中PCR擴增引物對應于百子蓮Aux/IAA3相關核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列 的兩側或中間。引物長度一般為15~50個核苷酸。
[0025] 此外，根據本發明的百子蓮Aux/IAA3核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源 性或表達蛋白質的同源性基礎上，篩選百子蓮Aux/IAA3相關同源基因或同源蛋白。
[0026] 為了得到與百子蓮Aux/IAA3相關基因的點陣，可以用DN