15存在下分化的人巨噬細胞中的CD64(FcyRI)表 達
[0310] 通過IC/FC分析巨噬細胞的⑶64表面表達，其中所述巨噬細胞在來自3位不同血 液供體的單核細胞或其前體與GM-CSF和CSF-I -起培養6日之后獲得。上半小圖：在來 自用單克隆抗體H27K15(左，粗線）或用GW2580(右，粗線）治療或其相應陰性對照利妥昔 單抗（左，細線）治療或無治療（右，細線）的供體1的培養物中的CD64染色。下半小圖： 用10、1或0.1 μ g/ml的測試化合物處理的巨噬細胞培養物中與熒光強度的中位數與相應 陰性對照中的那些中位數比較：H27K15對利妥昔單抗、H27K15衍生的F(ab'）2對利妥昔單 抗衍生的F(ab'）2、mAb2-4A5或9-4D2對大鼠 IgGl、GW2580對無處理。將CD64表達減少 的百分數計算為：l〇〇-[l00x使用測試化合物的熒光強度中位數/使用對照的熒光強度中 位數]。顯示來自3位血液供體的CD64表達減少的平均百分數。*例外是按等摩爾濃度： 6.6、0.6和0.06以8/1111使用的卩(&13'）2。
[0311] 圖3 :通過H27K15誘導CD86bl:ight SSC1?巨噬細胞群體
[0312] 上半小圖：顯示來自供體3的巨噬細胞的⑶86染色（X-軸）和側向散射（SSC， y-軸）的點圖，所述巨噬細胞在H27K15(左）或陰性對照利妥昔單抗（右）存在下分化6 日。對H27K15誘導的CD86toight SSdH胞群體設置門。下半小圖：采用10、1或0. lμg/ml 測試化合物時⑶86Mght SSC1?細胞的百分數與相應陰性對照中的那些百分數比較：H27K15 對利妥昔單抗、H27K15衍生的F(ab'）2對利妥昔單抗衍生的F(ab'）2、GW2580對無處理。將 CD86toight SSdH胞群體增加的百分數計算為：100x采用測試化合物時CD86bl:ight SSClm^ 胞百分數/采用對照時⑶86bIight SSC1?細胞的百分數。顯示來自3位血液供體的⑶86toightSSC1?細胞群體增加的平均百分數。*例外是F(ab'）2:6. 6、0. 6和0. 06μg/ml。
[0313] 圖4 :H27K15誘導IL-12p70分泌并增加巨噬細胞IL-12/IL-10比
[0314] 在來自巨噬細胞的培養上清液中滴定IL_12p70和IL-10,其中所述巨噬細胞在 mAb H27K15 (1 μ g/ml)、GW2580 (1 μ M)或它們的相應陰性對照利妥昔單抗存在下或無處理 時分化6日。左小圖：來自3位血液供體的巨噬細胞培養物中的IL-12p70水平和IL-10水 平（pg/mL)。右：對每位血液供體和每種培養條件計算IL-12p70(pg/mL)/IL-10(pg/mL)。 在其中不可檢出IL-12p70的樣品中（低于檢測限llpg/ml)，其水平是任意地設在lpg/ml 以計算 IL-12p70/IL-10 比。
[0315] 圖5 :H27K15抑制巨噬細胞分泌MCP-1/CCL2和IL-6
[0316] 在來自巨噬細胞的培養上清液中滴定MCP-I和IL-6,其中所述巨噬細胞在mAb Η27Κ15(1 μ g/ml)、GW2580(1 μΜ)或它們的相應陰性對照利妥昔單抗存在下或無處理時分 化6日。對于3位血液供體，將MCP-I產生（上半小圖）或IL-6產生（下半小圖）減少的 百分數計算為：100- [ IOOx采用測試化合物時的細胞因子濃度（pg/mL) /采用對照時細胞因 子濃度（pg/mL)]。
[0317] 圖 6.通過 mAb H27K15 下調 MMP-9 產生
[0318] 從3位不同血液供體分離的單核細胞在GM-CSF和CSF-I存在下，在具有或沒有 mAb H27K15、利妥昔單抗或GW2580的情況下分化6日。將MAb H27K15或利妥昔單抗（0. 1、 1或10 μ g/ml)或等摩爾濃度衍生自兩種mAb的F (ab) ' 2添加至培養物。通過ELISA (R&D Systems)滴定6日培養上清液中的MMP-9。
[0319] 圖7. MAb H27K15抑制CD163+M2型巨噬細胞的分化。
[0320] 收獲與GM-CSF和CSF-I -起培養6日后所獲得的細胞并且與含有人IgG Fc片段以飽和Fc受體的PBS在4 °C溫育20分鐘。隨后將熒光染料綴合的mAb(抗 CD14-PerCP-Cy5.5、抗 CD163-PE、抗 CD206-APC、抗 CDla-CDla-FITC，BD Biosciences)在 4°C與每份樣品溫育20分鐘。使用具有DIVA軟件的FACSLSR-II (BD biosciences)進行 FCM分析。展示來自3位不同血液供體的數據。
[0321] 圖8.通過mAb H27K15上調Ml: M2巨噬細胞比。
[0322] 來自2位不同供體的單核細胞與GM-CSF和CSF-I -起在1 μ g/ml的抗⑶115mAb H27K5或對照IgGjljS昔單抗存在或不存在下培養。在細胞分化6日后確定巨噬細胞群體 當中Ml (⑶14+⑶1630型巨噬細胞和M2 (⑶14+CD163+)型巨噬細胞之間的比例。
[0323] 圖9. MAb H27K15使得單核細胞分化偏向DC而非巨噬細胞。
[0324] 收獲與GM-CSF和CSF-I -起培養6日后所獲得的細胞并且與含有人IgG Fc片段以飽和Fc受體的PBS在4 °C溫育20分鐘。隨后將熒光染料綴合的mAb(抗 CD14-PerCP-Cy5.5、抗 CD163-PE、抗 CD206-APC、抗 CDla-CDla-FITC，BD Biosciences)在 4°C與每份樣品溫育20分鐘。使用具有DIVA軟件的FACSLSR-II (BD biosciences)進行 FCM分析。展示來自6位不同血液供體的數據。
[0325] 圖10. H27K15處理增加以GM-CSF和CSF-I分化的單核細胞的免疫刺激能力。
[0326] 在同種異型PBMC和來自用GM-CSF和CSF-I分化并用mAb H27K15或利妥昔單抗按 4個不同濃度處理6日的單核細胞中的細胞之間的MLR。T(-):未刺激的PBMC。T(+):用抗 CD3mAb (BD Pharmingen)和 IL-2(125n/ml)刺激的 PBMC，對應于 100%增殖。正在增殖的 PBMC的百分數計算為：采用測試mAb時的％ CFSE低細胞XlOO/采用T (+)時的％ CFSE-低 細胞。
[0327] 圖11.單克降抗體H27K15抑制與CSF-I或IL-34-起培養的單核細朐產牛MCP-I/ CCL2
[0328] 圖IlA :在48孔平板中與CSF-I或IL-34 -起在單克隆抗體H27K15或同種型對 照利妥昔單抗（二者均在1 μ g/ml)存在或不存在下培養6日后，滴定來自單核細胞衍生細 胞的培養上清液中的MCP-1/CCL2。使用來自測試的3位血液供體中一位血液供體代表的細 胞，獲得所示的結果。
[0329] 圖IlB :使用來自相同供體的在96孔板中以相似條件培養的細胞，平行評估細胞 生存力。生存力僅略微受H27K15抗體影響。 實施例
[0330] 在本研宄自始至終使用以下商業單克隆抗體：抗人⑶115mAb2-4A5-4(大鼠 IgGl.K，Santa Cruz)、9_4D2(大鼠 IgGl，Biolegend)和同種型對照大鼠 IgGl (R&D Systems)。 mAbl.2SM是專利申請WO 2009/026303中公開的序列1.2SM的抗CD115mAb。利妥昔單抗 從Roche獲得。通過胃蛋白酶消單克隆抗體，隨后通過凝膠過濾法純化在Transgene產生 F(ab '）2。
[0331] 人巨噬細胞分化分析：方案
[0332] 暗黃覆蓋層由 Etablissement Frangais du Sang(EFS，Strasbourg)提供。 通過在ficoll梯度上離心獲得外周血單核細胞（PBMC)。使用⑶14抗體包被的小珠 (Miltenyii)，通過免疫磁力細胞分選法純化單核細胞。富集的單核細胞懸液純度超過 95%。單核細胞在48孔平板（3xl05個細胞/孔）在補充有10%熱滅活的胎牛血清和1% 三抗生素混合物（青霉素、鏈霉素、新霉素）的RPMI-Glutamax?培養基中分化6日。從 第0日至第3日在細胞培養基中添加 GM-CSF(10ng/ml)。在第0日添加 H27K15、其他抗 體或內部對照GW2580 (LC Labs)。在分離后第3日，將單核細胞用PBS洗滌并且在補充有 CSF-l(10ng/ml)和GM-CSF(2ng/ml)的培養基中，在抗體或GW2580存在或不存在下進一 步培育。在第6日，將上清液收集并且儲存在-20°C。使細胞從塑料板脫離并且通過IC/ FC (免疫細胞化學/流式細胞術），對三次重復的庫分析細胞大小和Fc γ R和CD86的表達。 通過multiplex (Bioplex，Bio-Rad)或通過ELISA，對培養上清液中的細胞因子和趨化因子 定量。
[0333] 結果
[0334] 抗⑶115mAbH27K15對巨噬細胞無細胞毒性，但使其分化向Ml型極化
[0335] 為了研宄mAb H27K15是否可能影響巨噬細胞分化，將純化的⑶14+單核細胞在 已知分別誘導Ml巨噬細胞和M2型巨噬細胞的GM-CSF和CSF-I存在下培養7日(Akagawa K. S. . 2002： Verreck F.A.等人，2004)。將三個不同劑量的mab H27K15或同種型對照利妥 昔單抗（〇. 1、1或10 μ g/ml)在培養開始時并在3日后添加至培養基。在相等的摩爾濃度 平行測試從H27K15或從利妥昔單抗產生的F(ab'）2。測試從mAbl. 2SM(W0 2009/026303) 產生的F(ab'）2以便與衍生自H27K15或利妥昔單抗的F(ab'）2比較。分析針對人CD115 的已知阻斷性mAb、2-4A5或非阻斷性mAb9-4D2 (Sherr C. L等人，1989)并且與同種型對照 大鼠 IgGl比較。作為另一個對照，將小分子⑶115酪氨酸激酶抑制劑GW2580以1 μΜ(先 前顯示體外抑制人單核細胞的CSF-I依賴性增殖和鼠巨噬細胞分化的濃度）添加至某些培 養物(Conway T. G.等人，2005: Paniagua R. T.等人，2010) 〇
[0336] 6日培養物的顯微鏡觀察結果顯示，與未處理的細胞相比，在用Η27Κ15、利妥昔單 抗、mAb9-4D2、IgGl、H27K15F(ab'）2或利妥昔單抗F(ab'）2處理的孔之間無明顯差異，與 血液供體無關。就mAb SM1.2F(ab'）2處理的孔而言，對于所評價的3個劑量（0. 066、0. 66 和6. 6 μ g/ml)，觀察到全部供體的完全細胞毒性。就mAb2-4A5處理的孔而言，對于測試 的2個最高劑量（1 μ g/ml和10 μ g/ml)，觀察到全部供體的完全細胞毒性。對于最低劑 量（0. 1 μ g/ml)，細胞毒性僅是部分的。總之，這些結果沒有揭示除mAb SMI. 2F(ab'）2和 mAb2-4A5之外的任何抗體的任何毒性。對于采用1 μΜ對照GW2580的細胞，取決于顯微鏡 視野，將相對細胞毒性可視化為殘片，并且在全部血液供體中觀察到較低細胞密度。在第6 日通過計數平板每個孔中的5個顯微鏡視野（孔中心內一個視野和在中心和孔側面之間一 半距離處4個視野），分析細胞生存力。基于以上觀察結果，還對顯示部分或完全細胞毒性 的化合物（mAb SMI. 2F(ab'）2、mAb2-4A5和GW2580)處理的孔進行計數。圖1顯示通過各個 孔計數的5個視野的平均數土標準差。一些抗體顯示部分或完全細胞毒性。因此，與其相 應對照相比，衍生自mAb SMl. 2的F (ab '）2在全部濃度均引起嚴重細胞死亡，并且mAb2-4A5 也大幅度減少巨噬細胞數目。在GW2580存在下，與未處理的培養物相比，在第6日保留大 約70 %的巨噬細胞數目。
[0337] 通過IC/FC對第6日培養物分析活化性Fc γ R CD64 (Fe γ RI)的表面表達和活化標 志物⑶86的表面表達。如圖2上顯示，用Η27Κ15或用GW2580處理時，⑶64的表面表達大 幅度減少。Η27Κ15在測試的全部劑量幾乎完全抑制⑶64表達。大鼠抗人⑶115mAb2-4A5 還減少⑶64表面表達，但是以劑量依賴性方式減少表達。非⑶115阻斷性mAb9-4D2不調 整⑶64表達水平。有趣地，衍生自H27K15的F(ab'）2還下調⑶64表達，但是比完整mAb 力度更弱并且僅在1 μ g/ml或10 μ g/ml測試時如此，顯示H27K15的作用部分地依賴Fe。
[0338] 在第6日巨噬細胞中分析激活標志物/共刺激分子⑶86的表達時，我們發現以 CD86toight SSCltw表型為特征的細胞亞群出現在用mAb H27K15或用GW2580處理的培養物中 (圖3)。未觀察到用H27K15衍生的F(ab'）2誘導這個圓形細胞群體表達高水平的⑶86,提 示這個現象中H27K15FC區的功能。對這個群體設門顯示CD86bHght SSC1qw細胞主要是CD64 低至⑶64-陰性（數據未顯示）。
[0339] 滴定第6日培養上清液中的IL_12p70和IL-10。與人IgGjIj妥昔單抗一起 培養或無試劑情況下培養之后，來自所測試的3位供體的巨噬細胞不產生任何可檢測的 IL-12p70。在mAb H27K15存在下的培養誘導來自3位血液供體中2位供體的巨噬細胞分 泌IL-12p70。相反，用GW2580處理后檢測不到IL-12p70(圖4)。由來自全部供體的靜息 性巨噬細胞產生的IL-10因 H27K15在來自供體1的巨噬細胞中上調，但是在供體2中不上 調，并且在供體3中僅微弱增加。因此，IL-12p70/IL-10比在測試的3位血液供體中上調 (圖4,右小圖）。小分子GW2580還增加 IL-12p70/IL-10比，但是還歸因于抑制IL-10產 生。
[0340] 這些結果顯示，用mAb H27K15靶向正在分化的巨噬細胞上的⑶115不僅大幅度 下調⑶64/Fc γ RI的表達，還誘導表達高水平⑶86活化標志物的SSC1?細胞群體。此外， Η27Κ15可以在全部供體中誘導IL-12p70產生并上調IL-12p70/IL-10比，表示巨噬細胞向 Ml型極化。
[0341] 令人震驚地，發現當巨噬細胞在mAb H27K15或GW2580存在下分化時，趨化因子 MCP-1/CCL2的產生幾乎被完全抑制（圖5,上半小圖）。在測試的3位供體中，通過H27K15 對MCP-I分泌的抑制是有效并且范圍是74%至99%。小分子GW2580在抑制MCP-I產生 方面與H27K15同樣有效。在全部供體中，第6日巨噬細胞培養上清液中的IL-6水平也因 H27K15或GW2580降低（圖5,下半小圖）。與采用GW2580(從75%至96% )相比，H27K15 抑制IL-6產生的幅度較小（從27%至70% )。H27K15介導對巨噬細胞產生MCP-I和 IL-6 (Roca H.等人，2009)(兩種涉及M2巨噬細胞極化的可溶性因子）的抑制是另一項表 明抗⑶115mAb使巨噬細胞向Ml再極化的證據。
[0342] 抗CD115mAb H27K15抑制與GM-CSF和CSF-I -起培養的單核細胞產生