對單核細胞或其前體分化的調節的制作方法
【專利說明】對單核細胞或其前體分化的調節
[0001] 發明概述
[0002] 本發明總體上涉及通過施用調節單核細胞或其前體分化的化合物促進樹突細胞 (DC)驅動的免疫反應和任選地Ml型（巨噬細胞Ml極化）免疫反應。本發明涉及能夠與 CSF-IR結合的抗體用于調節單核細胞或其前體分化、更具體地用于誘導單核細胞或其前體 向樹突細胞和/或Ml極化巨噬細胞而非M2極化巨噬細胞分化的用途。本發明也涉及通過 評估在體內或在體外評估單核細胞或其前體分化成巨噬細胞（Ml型或M2型）和/或樹突 細胞，在患者中評價能夠與CSF-IR結合的抗體的劑量功效的方法。
[0003] 本發明還涉及評估能夠與CSF-IR結合的抗體對正在治療的受試者影響的治療后 伴隨檢驗和分析。
[0004] 在炎癥期間，循環型單核細胞被募集至炎癥部位，在那里，它們采取由特定細胞因 子和生長因子的存在所決定的巨噬細胞表型。成熟的巨噬細胞分裂為兩個群體，Ml極化或 "經典活化"和M2極化或"旁路活化"。巨噬細胞是重要的腫瘤浸潤性細胞并且在腫瘤生長 和轉移中發揮關鍵作用。在大部分實體瘤中，巨噬細胞的存在有利于腫瘤生長和轉移。最 近的研宄顯示腫瘤相關的巨噬細胞（TAM)顯示M2表型。這些腫瘤相關的巨噬細胞（TAM) 產生白介素 IL-10和轉化生長因子（TGF) β以抑制總體抗腫瘤免疫反應。同時，TAM通過分 泌促血管生成因子促進腫瘤新生血管生成并限定侵入性微環境以促進腫瘤轉移和散播。出 于這些理由，已經將選擇性耗盡Μ2ΤΑΜ視為抗癌療法的新方案（Sica等人，2006, European Journal of Cancer,42, 717-727)〇
[0005] 巨噬細胞以極化方式參與針對腫瘤的免疫反應。Ml分化由GM-CSF觸發并進一步 受干擾素 -γ (IFN-γ)、細菌脂多糖（LPS)或腫瘤壞死因子a (TNFa)刺激，并且由涉及信 號轉導蛋白和轉錄激活物（STAT)、活化性B細胞的核因子K-輕鏈促進子（NFkB)和促分 裂原活化蛋白激酶（MPK)的幾條信號轉導途徑介導。這些事件增強如活性氧類和一氧化 氮（NO)之類的物質的產生并通過增加抗原呈遞能力并借助細胞因子如IL12的產生誘導 Thl免疫力，促進后續的炎性免疫反應。相比，M2巨噬細胞極化用來描述以Ml極化之外的方 式活化的巨噬細胞，所述巨噬細胞包括IL4/IL13刺激的巨噬細胞、ILlO誘導的巨噬細胞和 免疫復合物觸發的巨噬細胞。在Ml極化與M2極化之間的許多分子差異當中，IL12和ILlO 的產生比對區分Ml和M2巨噬細胞至關重要。明顯地，TAM分享許多M2巨噬細胞特性。
[0006] TAM顯示這樣的M2譜，其特征不僅在于IL-12is IL-IOs表型，還在于與調節功能相 關的高的 FcR 介導吞噬能力（Schmieder 等人，2〇12, SeminCancerBiol.，22, 289_297)。已 經鑒定血紅蛋白清道夫受體（⑶163)為TAM表達的M2極化巨噬細胞的標志物（Ambarus等 人，2012, 375, 196-206)。TAM可以代表腫瘤微環境中由CSF-I和CCL-2 (MCP-I)募集的最 豐富免疫抑制性細胞群體（Sica等人，2006, EurJCancer.，42, 717-727)。
[0007] 類似地，旁路活化的M2巨噬細胞已經涉及幾種病理學，其中最明顯的是過敏反 應和哮喘（Duffield，2003, Clin. Sci. 104, 27 ;Gordon，2003, Nat. Rev. Immunol·，3, 23; Dagupta 和 Keegan, J. Innate Tmmun.，2012, 4, 478)〇
[0008] 發明人已經現在顯示，通過施用調節單核細胞或其前體分化的化合物，某些單克 隆抗體能夠促進DC免疫反應和任選地Ml型（巨噬細胞Ml極化）免疫反應。他們已經顯 示所述單克隆抗體能夠下調表面Fc γ RI (CD64)和Fc γ RIII (CD16)以下調MCP-I (巨噬細 胞趨化蛋白1，也稱作CCL-2)、IL-6、ΜΜΡ9和/或IL-IO產生，并且以促進IL-12、IL-I α、 TNF-α產生。他們已經進一步顯示所述單克隆抗體抑制來自人單核細胞的⑶163"Μ2型巨 噬細胞的分化并反而促進單核細胞分化成DC，并任選地促進巨噬細胞Ml極化。
[0009] 發明公開
[0010] 本發明廣泛地涉及通過調節單核細胞分化用于免疫調節的方法。
[0011] 本發明更具體地涉及通過使合適前體細胞（通常單核細胞或其前體）暴露于有效 劑量的能夠與CSF-IR結合的抗體，體內或離體產生樹突細胞的方法。因此生成的樹突細胞 可以特征在于表達樹突細胞標志物，如⑶la、⑶14、⑶86、⑶Ib等。
[0012] 在本發明的方法中，通過使前體細胞（通常單核細胞）與有效劑量的能夠與 CSF-IR結合的抗體接觸，從前體細胞產生樹突細胞。前體細胞可以通過本領域已知的方法 從合適的生物樣品分離，并且可以是分離的或在復雜的細胞群體中提供。
[0013] 除非上下文另外清楚地說明，否則如完整申請書通篇范圍內所用，術語"一（a) "和 "一個（an) "以這樣的意思使用，從而它們意指"至少一個"、"至少第一個"、"一個或多個"或 "多個"所指示的組分或步驟。例如，術語"一個細胞"包括多個細胞，包括其混合物。
[0014] 無論在本文中何處使用，術語"和/或"包括"和"、"或"和"由所述術語連接的要 素的全部或任何其他組合"的意思。
[0015] 如本文中所用的術語"約"或"大約"意指在給定值或區間的20 %范圍內，優選 10%范圍內并且更優選5%范圍內。術語"約X"還包括X值。
[0016] 本文中所用，"包含著"和"包含"意在表示組件套裝、產物、組合物和方法包括所指 的組分或步驟，但不排除其他組分或步驟。例如，"一種包含X和y的組合物"涵蓋含有X和 y的任何組合物，無論其他組分是否可能存在于該組合物中。同樣地，"一種包括步驟X的 方法"涵蓋其中實施X的任何方法，無論X是否為該方法中的唯一步驟或它僅是步驟之一， 無論其中可能有多少其他步驟并且無論X與之相比多么簡單或復雜。
[0017] 當用來定義產物、組合物和方法時，"基本上由……組成"應當排除具有任何實質 意義的其他組分或步驟。因此，基本上由所提及組分組成的組合物不會排除痕量污染物和 可藥用載體。"由……組成"應當意指排除其他組分或步驟的超過痕量的要素。
[0018] 根據第一實施方案，本發明涉及一種通過調節患有與不希望的M2巨噬細胞極化 相關的病狀的患者中的單核細胞或其前體分化進行免疫調節的方法，其中所述方法包括步 驟：向所述患者施用有效量的能夠與CSF-IR結合的抗體。本發明更具體地涉及這種用于免 疫調節的方法，其中所述患者還患有與CSF-IR活性相關的病狀。
[0019] 根據一個具體實施方案，本發明涉及能夠與人CSF-IR結合的抗體用于調節單核 細胞或其前體分化，特別地在患有與不希望的M2巨噬細胞極化相關的病狀的患者中調節 的用途。根據一個具體實施方案，所述患者還患有與CSF-IR活性相關的病狀。
[0020] 本申請涉及"調節單核細胞或其前體分化"。這個術語意指本發明的調節性抗體引 起M2巨噬細胞極化庫減少和/或樹突細胞（DC)庫增加和任選地Ml型（巨噬細胞Ml極化） 庫增加，優選地M2巨噬細胞極化庫減少和樹突細胞（DC)庫增加。如本文中公開，這可以由 與M2巨噬細胞相關因子的水平的變化指示。這類因子的例子是膜標志物如CD64或CD163、 細胞因子如IL6、ILlO或IL12、MCP-1、MMP9等。這種在患者中"調節單核細胞或其前體分 化"可以例如通過向患者施用能夠與CSF-IR結合的本發明抗體之后測量到IL12/IL10比、 MCP-I或IL-6水平增加來理解。
[0021] 如本文所用，樹突細胞（DC)指在淋巴樣組織或非淋巴樣組織中存在的具有形態 相似的細胞類型的多樣性群體的任何成員。樹突細胞（DC)是用于啟動T細胞的介導免疫 反應的特化抗原呈遞細胞（APC)。DC在誘導免疫力方面的效率在組織培養和完整動物模型 中是明顯的。當T細胞是靜息的或與特定抗原（Ag)反應的T細胞的前體頻率低時，這是特 別明顯的。DC富含I類和II類主要組織相容性復合體（MHC)分子，并且它們的共刺激分子 和粘附分子為其提供比其他APC的這些分子更成熟和更有力的輔助特性。
[0022] DC表達高水平的I類和II類MHC分子產物。這些分子用于向T淋巴細胞呈遞來自 蛋白質的肽片段。抗原呈遞本身不產生免疫力。需要額外的"第二信號"或輔助分子。這些 輔助分子中許多是與T細胞上特定受體相互作用的膜糖蛋白。這些輔助分子在DC上以高水 平表達并且包括：LFA-3 (CD58)、B7-1 (CD80)和 B7-2 (CD86)、ICAM-I (CD54)和 ICAM-3 (CD50) 和⑶40。其他APC可以表達這些輔助分子，但是DC上的水平特別高。
[0023] DC具有比它們的髓樣近親低得多的吞噬能力性，并因此缺乏針對免疫復合物 (FcyR)或C3及其片段的受體。低水平的CD32FcyR和CDllbC3biR可能存在，特別地當 DC未完全成熟時。終末分化的DC表達標志物⑶Ia并缺少⑶14, 一種在巨噬細胞上更豐富 并且介導吞噬細胞對脂多糖（LPS)和LPS結合蛋白反應的受體。實質上，為了作為高效呈 遞抗原至靜息T細胞之基礎的極高水平的MHC產物和輔助分子，DC分化途徑犧牲了吞噬細 胞的許多清除特性和抗微生物特性。
[0024] 根據本發明分析細胞表面以表征/或鑒定/或追蹤DC出現可以根據一個實施方 案使用單克隆抗體，使用流式細胞儀、磁力分選等進行。簡而言之，將細胞與直接綴合于熒 光染料的單克隆抗體組合或與未綴合的第一抗體和隨后與綴合于熒光染料的市售第二抗 體組合。使用例如流式細胞儀（例如，如從Becton Dickinson, Mountain View, Calif.可 獲得），分析染色的細胞。DC的額外表型特征還可以通過基因表達概況分析表征，例如通過 逆轉錄酶聚合酶鏈反應（RT-PCR)表征。
[0025] 根據另一個實施方案，本發明涉及一種在患者、特別地患有與不希望的M2極化相 關的病狀的患者中增加樹突細胞（DC)庫并且任選地Ml型巨噬細胞庫的方法，其中所述方 法包括步驟：向所述患者施用有效量的能夠與CSF-IR結合的抗體。本發明更具體地涉及這 種用于免疫調節的方法，其中所述患者還患有與CSF-IR活性相關的病狀。
[0026] 根據具體實施方案，所述在患有與不希望的M2極化相關的病狀的患者中增加樹 突細胞（DC)庫和任選地Ml型巨噬細胞庫的方法還減少巨噬細胞M2庫。
[0027] "患者"意指脊椎動物，如哺乳動物，如人。哺乳動物包括但不限于人、犬、貓、馬、奶 牛和豬。根據本發明的，"患者"正患有與不希望的M2極化相關的病狀，并且根據具體實施 方案還患有與CSF-IR活性相關的病狀。
[0028] 本發明是還更具體地涉及一種在患者中、特別在患有與不利巨噬細胞分化和M2 極化相關的病狀和/或患有與CSF-IR活性和/或癌癥誘導的免疫抑制相關的病狀的患者 中減少、尤其通過使其分化偏向DC而減少巨噬細胞促腫瘤功能（即致瘤性）和/或增加腫 瘤抑制活性的方法，其中所述方法包括步驟：向所述患者施用有效量的能夠與CSF-IR結合 的抗體。
[0029] 根據具體實施方案，本發明的方法阻遏在腫瘤侵入、轉移、腫瘤細胞增殖、腫瘤生 長、腫瘤存活、新生血管生成、抑制天然免疫或適應性免疫和胞外基質重塑組成的組中選出 的至少一種巨噬細胞促腫瘤功能。
[0030] 因此，就本發明而言，"調節單核細胞或其前體分化"還可以意指本發明的調節性 抗體減少在腫瘤侵入、轉移、腫瘤細胞增殖、腫瘤生長、腫瘤存活、新生血管生成、抑制適應 性免疫或天然免疫和胞外基質重塑組成的組中選出的至少一種巨噬細胞促腫瘤功能（即 致瘤性）。
[0031] 根據具體實施方案，本發明的方法通過分化單核細胞或其前體，抑制MCP-I、MMP_9 和IL-6產生。
[0032] 根據具體實施方案，本發明的方法下調正在分化的單核細胞或其前體上的表面 Fc γ RI (CD64)和 Fc γ RIII (CD16)表達。
[0033] 根據具體實施方案，本發明的方法通過分化單核細胞或其前體促進IL-12 (更具 體地IL-12P70形式）產生和/或上調IL-12/IL-10比。
[0034] 根據具體實施方案，本發明的方法借助分泌的因子，調節單核細胞或其前體分化。
[0035] 根據具體實施方案，本發明的方法減少患者中，特別地在患有與不希望的M2巨噬 細胞極化相關的病狀的患者中以下至少一個種情況：
[0036] * TAM募集入腫瘤；
[0037] *至少一種巨噬細胞促腫瘤功能；
[0038] *腫瘤血管生成；
[0039] *腫瘤侵入和轉移；
[0040] *腫瘤生長；
[0041] *腫瘤細胞增殖。
[0042] 根據具體實施方案，所述患者還患有與CSF-IR活性相關的病狀。
[0043] 本發明也涉及在患者中、特別在患有與不希望的巨噬細胞分化和M2巨噬細胞極 化相關的病狀的患者中或在患有與CSF-IR活性和/或癌癥誘導的免疫抑制相關的病狀的 患者中驅動巨噬細胞趨向樹突細胞（DC)免疫反應和任選地Ml型巨噬細胞免疫反應和/或 遠離M2型（巨噬細胞M2極化）免疫反應的方法，其中所述方法包括步驟：向所述患者施用 有效量的能夠與CSF-IR結合的抗體。
[0044] 本發明也涉及在患者中、特別在患有與不希望的巨噬細胞分化和M2巨噬細胞極 化相關的病狀的患者中或在患有與CSF-IR活性和/或癌癥誘導的免疫抑制相關的病狀的 患者中驅動巨噬細胞趨向Thl免疫反應或遠離Th2免疫反應的方法，其中所述方法包括步 驟：向所述患者施用有效量的能夠與CSF-IR結合的抗體。
[0045] 本發明也涉及能夠與CSF-IR結合的抗體用于調節單核細胞或其前體分化成DC和 任選地Ml型巨噬細胞的用途。本發明也涉及能夠與CSF-IR結合的抗體用于驅動單核細胞 或其前體向DC和任選地Ml型巨噬細胞分化以刺激免疫反應的用途。本發明也涉及能夠與 CSF-IR結合的抗體用于誘導正在分化的單核細胞或其前體以刺激Thl型免疫反應的用途。 本發明也涉及包含能夠結合CSF-IR的抗體的組合物，如藥物組合物用于調節單核細胞或 其前體分化、用于驅動單核細胞或其前體向DC和任選地Ml型巨噬細胞分化和/或誘導正 在分化的單核細胞或其前體以刺激Thl型免疫反應的用途。
[0046] 如本文所用，術語"能夠結合"指在蛋白質和其他生物制品的異質群體存在下決 定靶蛋白的存在的結合反應。因此，在指定的測定條件下，本發明抗體偏好地與CSF-IR的 至少部分結合并且優選地不以明顯的量與試驗樣品中存在的其它組分結合。本發明抗體 與CSF-IR靶之間的特異性結合意指結合親和力是至少IO3M4并且優選地是10 5M^lO6M' IO7M'IO8M'IO9IT1或 10 10M'
[0047] 如本文所用，術語"CSF-1R"指人CSFl受體。
[0048] 如本文中所用，"抗體"或"Ab"以最廣泛的含義使用。因此，"抗體"或"Ab"可以 是天然存在的或人造的，如通過常規雜交瘤技術、重組技術產生的單克隆抗體