豬細小病毒5b、用法及疫苗的制作方法
【專利說明】
[0001] 序列表
[0002] 本申請案含有符合37C. F. R. 1. 821-1. 825之序列表。本申請案隨附之序列表特此 以全文引用方式并入。該ASCII復本系在2013年3月21日創建，命名為10-0153-PCT-SEQ. txt且大小為34, 495個字節。
技術領域
[0003] 本發明屬于動物健康領域且涉及新穎豬細小病毒菌株（包括用于接種之減毒菌 株）、制造方法及使用自該等新穎細小病毒菌株獲得之疫苗之治療方法。
【背景技術】
[0004] 細小病毒感染眾多種動物物種且一些細小病毒導致嚴重臨床疾病，但該等病毒 中大多數僅引起輕度或亞臨床感染。其屬于細小病毒科（Parvoviridae)且形成兩個亞 科：濃核病毒亞科（Densovirinae)，其成員感染昆蟲；及細小病毒亞科（Parvovirinae)， 其成員感染脊椎動物。后一亞科目前包括5個屬：依賴病毒屬（Dependovirus)、紅病毒屬 (Erythrovirus)、紹阿留申病毒屬（Amdovirus)、博卡病毒屬（Bocavirus)及細小病毒屬 (Parvovirus)(1)〇
[0005] 細小病毒病毒體無包膜且含有約5至6千個堿基（kb)之單股線性DNA基因組。該 基因組由編碼非結構蛋白及衣殼蛋白之兩個主要開放閱讀框（ORF)組成。最近闡述之博卡 病毒攜帶位于該兩個主要ORF之間之第三ORF(I)。
[0006] 細小病毒屬之典型豬細小病毒（PPVl)菌株廣泛分布于世界各處且造成豬之生殖 障礙，尤其在未正確地實施接種方案或疫苗功效因免疫抑制因子而下降之畜群中。在過去 十年期間，已在豬中檢測到多種新細小病毒。該等包括豬細小病毒2 (PPV2) (2)及相關病毒 (3)。在香港鑒定出一組新的豬及牛細小病毒，即胡可病毒（hokovirus) (PhoV、BHoV) (4)， 且發現該等病毒與人類PARV4及5在遺傳上相似。盡管其最初系以香港命名為香港病毒， 但有人提出新將其PHoV分類為PPV3 (5)。PPV4顯示與牛細小病毒2相似性最高，但編碼容 量及基因組組構與博卡病毒之那些相似，因為PPV4同博卡病毒一樣編碼位于ORFl與0RF2 之間之另一 0RF3。然而，PPV4編碼之推定0RF3蛋白顯著不同于博卡病毒編碼之推定0RF3 蛋白（5)。
[0007] 業內一直需要監測豬之新病毒之出現且需要針對新病毒研發疫苗、治療及檢測方 法。
【發明內容】
[0008] 本發明提供新穎核苷酸序列、蛋白序列、免疫原性組合物、疫苗及關于制備及使用 尤其感染馴養豬之新細小病毒菌株之方法。該等菌株與在來自臨床上發病之馴養豬之組織 樣品中鑒定之新穎豬細小病毒相關；基于與已知豬細小病毒物種及菌株之序列同源性，將 該新穎病毒命名為豬細小病毒5B或PPV5B。
[0009] 本發明之組合物及方法供以檢測由該新病毒導致之感染、監測野生及馴養動物及 畜群中病毒序列之遺傳改變、及制備及使用新穎疫苗用以保護動物免于感染該病毒。
[0010] 本發明之免疫原性組合物及疫苗包含由SEQ ID NO: 1之核酸序列編碼之多肽序列 或其免疫原性片段，視情況包括佐劑用以誘導更強的免疫原性反應。
[0011] 本發明之例示性組合物包含對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性之SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:3、SEQ N0:4之多肽序列中之任一者或其片段。本發明之較佳多肽包括SEQ ID NO:4之序列。較佳地，那些多肽或其片段對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性。
[0012] 在另一方面中，本發明提供編碼一或多種多肽、抗體構建體或抗體綴合物之核酸 序列。編碼多肽之基因序列包含與SEQ ID N0:1之序列至少95%、90%、85%或甚至80%同 源性及/或相同性之核酸序列，具體而言，編碼對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性 之多肽之SEQ ID NO: 1之第2861位第至5014位核苷酸序列（衣殼蛋白）或SEQ ID NO: 1 之片段。本發明之例示性核酸序列包括編碼對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性之 多肽之SEQ ID NO: 1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO: 1之第2161位至第2860 位核苷酸及SEQ ID NO: 1之第2861位至第5014位核苷酸之序列中之任一者及其片段。較 佳地，該等核酸序列或基因系編碼對特異性針對PPV5B之抗體具有免疫反應性之多肽或肽 之那些。
[0013] 此外，本文所用本發明之多肽包括但不限于包含以下多肽：
[0014] i)包含 SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3 或 SEQ ID NO:4 之氨基酸序列之多肽；
[0015] ii)與i)之多肽至少80%同源性及/或相同性之多肽；
[0016] iii) i)及/或ii)之多肽之片段；
[0017] iv)包含SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4之序列中所包括之至少13個、較佳地15 個、更佳地17個、甚至更佳地20個鄰接氨基酸之iii)或iv)之片段；
[0018] V)由包含SEQ ID NO: 1之第935位至第2024位核苷酸、SEQ ID NO: 1之第2161 位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO: 1之第2861位至第5014位核苷酸之序列之多核苷酸 編碼之多肽；
[0019] vi)由與vi)之多核苷酸至少80%同源性或相同性之多核苷酸編碼之多肽；
[0020] vii)由包含SEQ ID NO: 1之第2161位至第2860位核苷酸或SEQ ID NO: 1之第 2861位至第5014位核苷酸之序列中所包括之至少39個、較佳地45個、更佳地51個、甚至 更佳地60個鄰接核苷酸之多核苷酸編碼之蛋白質片段。
[0021] 包含至少一種或多種如本文所定義PPV5B多肽之本發明免疫原性組合物可進一 步包含生理學上可接受之媒劑，例如醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。
[0022] 此處所提供之PPV5B多肽中之任一者或任何包含此處所提供之該等PPV5B多肽中 之一或多者之免疫原性組合物皆可用作藥劑，較佳地用作疫苗或免疫原性組合物，最佳地 用于預防或治療對象以對抗PPV5B感染。
[0023] 特別佳之PPV5B多肽包括具有誘導對特異性針對PPV5B之免疫反應之免疫原性表 位之那些。較佳PPVB多肽包括具有預計在相關PPVl中為表面抗原之氨基酸序列之那些 (Simpson等人，JMB 315, 2002)且包括但不限于SEQ ID N0:4之第289位、第375位至第 381位及第431位至443位殘基。
[0024] 熟習此項技術者應了解，本文所用組合物可納入已知可注射生理學上可接受之無 菌溶液。對于制備用于非經腸注射或輸注之即用溶液，水性等滲溶液（例如鹽水或血漿蛋 白質溶液）可容易地得到。另外，本發明之免疫原性及疫苗組合物可包括獸醫學上可接受 之載劑、稀釋劑、等滲劑、穩定劑或佐劑。
[0025] 本發明方法包括但不限于在對象中激發對抗PPV5B感染之免疫反應之方法，該方 法包含向對象施用包含一或多種如本文所定義PPV5B多肽之免疫原性組合物之步驟。較佳 地，所激發免疫反應對抗多于一種PPV5B血清型或菌株。本發明組合物可用于治療或另一 選擇為預防PPV5B感染。較佳地，該免疫反應降低與感染一或多種PPV5B血清型相關或因 感染一或多種PPV5B血清型而引起之一或多個臨床體征之發生率或嚴重程度。
[0026] 在本文中，可施用本發明組合物之適宜對象及有需要的對象包括需要預防或治療 相關病毒性、微生物性、寄生性、原蟲性、細菌性或真菌性感染、疾病或病況的動物。利用本 發明組合物或方法刺激免疫反應之動物包括家畜，例如豬、牛、家禽（例如雞、鴨、鵝或火 雞）、山羊及綿羊；以及馴養動物，例如小鼠、兔、狗、貓及馬。較佳之動物包括豬、鼠科動物、 馬科動物、兔類動物及牛科動物。最佳地，刺激豬之免疫反應。
[0027] 本發明亦提供降低與PPV5B感染相關或由該感染引起之一或多個臨床體征之發 生率或嚴重程度之方法，其包含施用包含一或多種由此提供之PPV5B肽及較佳地載劑分子 之本發明之免疫原性組合物之步驟，以使得PPV5B感染之臨床體征之發生率或嚴重程度相 對于未接受由此提供之免疫原性組合物之對象降低至少10%、較佳至少20%、甚至更佳至 少30%、甚至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。該等臨床體征包括僅因 感染PPV5B導致之病毒血癥及免疫抑制。該等臨床體征可包括神經學體征（情緒低落、共 濟失調、嗜睡）、腹瀉、呼吸困難、體況下降、關節腫脹（導致跛行及仰臥）、平均日增重減少、 死亡率及與另一生物體（例如，豬鼻霉衆菌（Mycoplasma hyorhinis))共感染導致之多發 性漿膜炎。
[0028] 根據又一方面，本發明亦關于預防PPV5B感染之方法，其中該PPV5B感染可能由 PPV5B引起，該PPV5B與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有100%序列相同性；與SEQ ID NO: 1 之核苷酸序列具有至少95%序列相同性；與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有至少90%序 列相同性；或與SEQ ID NO: 1之核苷酸序列具有至少85%序列相同性；該方法包含施用本 發明之免疫原性組合物之步驟，該免疫原性組合物包含一或多種由此提供之PPV5B肽，即， 至少一種分別與SEQ ID N0:3及/或SEQ ID NO:4之多肽序列具有100%、至少95%、至少 90%及/或至少85%序列相同性之多肽或其包含SEQ ID N0:3及/或SEQ ID N0:4之序列 中所包括之至少12個、較佳地15個、更佳地17個、甚至更佳地20個鄰接氨基酸之片段。
[0029] 本發明亦提供制備任一由此提供之免疫原性組合物之方法，該方法包含將一或多 種由此提供之PPV5B肽與載劑分子混合，較佳地使得該一或多種PPV5B肽與載劑分子系彼 此共價偶合或綴合。該等綴合物可為多價或單價。多價組合物或疫苗包括多種PPV5B肽與 載劑分子之免疫綴合物。在又一方面中，本發明提供制造一或多種PPV5B肽之方法，該方法 包含用編碼任一由此提供之PPV5B肽之核酸分子轉化宿主細胞、較佳地原核細胞（例如大 腸桿菌（E. coli))。另一選擇為，宿主細胞可為真核細胞，例如動物細胞、昆蟲細胞、原蟲細 胞、植物細胞或真菌細胞。較佳地，真核細胞系哺乳動物細胞，例如CH0、BHK或COS ;或真菌 細胞，例如啤酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae);或昆蟲細胞，例如Sf9。本發明核酸 之桿狀病毒表達亦較佳。
[0030] 本發明之另一方面提供制造一或多種PPV5B肽之方法，該等PPV5B肽誘導對抗至 少一種PPV5B遺傳變體且更佳地兩種或更多種PPV5B遺傳變體之免疫反應。此包含培養編 碼并表達一或多種本文所揭示PPV5B肽之經轉化表達載體。經表達蛋白質系保留在表達生 物體中或分泌至培養基中。表達系在足以產生能夠誘導對PPV5B之免疫反應之PPV5B肽 之條件下進行。致使PPV5B肽誘導免疫反應之PPV5B血清型包括但不限于具有至少99%、 98%、97%、96%、95%、94%、93%、92%、91%或 90%相同性之序列。
[0031] 制備本發明組合物之方法可進一步包含混合一或多種PPV5B肽與載劑分子之綴 合物與生理學上可接受之媒劑，例如醫藥上或獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。熟習 此項技術者應認識到，媒劑、佐劑或組合之選擇將尤其由遞送途徑、個人偏好及動物種類來 決定。
[0032] 在另一方面中，本發明提供診斷對象之PPV5B感染之方法。該方法包含提供一或 多種PPV5B肽；使該一或多種PPV5B肽與自該對象獲得之樣品接觸；及若在該樣品中檢測 到能夠結合該一或多種PPV5B肽之抗體，則將該對象鑒定為具有PPV5B感染。
[0033] 在另一方面中，本發明提供確定先前已暴露于PPV5B感染且能夠表達對PPV5B之 免疫反應之對象之方法。該方法包含提供一或多種PPV5B肽；使該一或多種PPV5B肽與自 該對象之獲得樣品接觸；及若在該樣品中檢測到能夠結合該一或多種PPV5B肽之抗體，則 將該對象鑒定為具有PPV5B感染。
[0034] 本發明亦提供試劑盒，其包含：包含一或多種PPV5B肽、較佳地連同載劑分子之免 疫原性組合物；用于封裝該免疫原性組合物之容器；一套印刷說明書；及能夠向動物施用 該免疫原性組合物之分配器。視情況，該一或多種PPV5B肽及該載劑分子可以綴合物形式 或以單獨化合物形式封裝。當單獨供應時，亦供應綴合該一或多種PPV5B肽與載劑分子之 構件以及適當印刷說明書。
[0035] 本發明亦提供用于接種動物之試劑盒，其包含一套印刷說明書；能夠向動物施用 由此提供之包含一或多種PPV5B肽之該免疫原性組合物之分配器；且其中PPV5B肽中之至 少一者有效地免疫該動物以對抗至少一種與PPV5B感染相關之疾病。較佳地，該一或多種 PPV5B肽系選自由此提供之那些。本發明試劑盒可進一步包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑 或其組合。
[0036] 本發明試劑盒中之分配器能夠將其內含物以微滴形式分配；且該試劑盒中所包括 之包含此處所提供之PPV5B肽之該免疫原性組合物在經鼻內、經口、真皮內或肌內施用動 物時能夠降低PPV5B感染之至少一個臨床體征之嚴重程度。較佳地，使臨床體征之嚴重程 度與未經治療之受感染動物相比降低至少10%、較佳地至少20%、甚至更佳至少30%、甚 至更佳至少50%、甚至更佳至少70%、最佳至少100%。
[0037] 本發明亦揭示治療或預防由PPV5B引起之感染之方法。該方法包含向對象施用有 效量之本發明之免疫原性組合物，其中該治療或預防系選自由下列組成之群：減少PPV5B 感染之體征、降低PPV5B感染臨床體征之嚴重程度或發生率、降低由PPV5B感染引起之對象 死亡率及其組合。
[0038] 本發明組合物進一步包含獸醫學上可接受之載劑、佐劑或其組合。該等組合物 可用作疫苗且包含一或多種其它減毒疫苗、滅活疫苗或其組合。該等疫苗引發對抗至少 一種與選自由下列組成之群之病毒相