次補料每天補料；方塊：雙次 補料每天補料；三角：單次補料譜補料；X :雙次補料譜補料 實施例
[0104] 材料和方法
[0105] 細朐系：
[0106] 示例性的CHO細胞系是包含編碼根據EP 0 409 607和US 5, 795, 965的抗IL-6 受體抗體的核酸的CHO細胞系，所述示例性的CHO細胞系中重組生產的免疫球蛋白的甘露 糖-5糖基結構的量可以被修改。為了培養重組CHO細胞，能夠使用任何培養基，只要能夠 實施根據本發明方法的葡萄糖補充。示例性的培養基是頂DM、DMEM或Ham's F12基質或 其組合，所述培養基已經被改造適合于本文報道的方法所采用的培養基組分與葡萄糖的質 量比。也能從培養基中排除葡萄糖并將其分別添加到培養中。
[0107] 培養:
[0108] 在11或21發酵容器中培養表達抗IL-6R抗體的CHO細胞。補料培養基含有15 至40g/l葡萄糖。能夠用含有例如400g/l葡萄糖的單獨的濃縮溶液補料葡萄糖。在從pH 7. 0至pH 7. 2的范圍內的pH值下實施培養。
[0109] 測定糖基結構:
[0110] 為了分析IgG糖基化模式，使用根據Kondo等人（Kondo, A.等人，Agric. Biol. Chem. 54(1990)2169-2170)的方法。使用小規模的蛋白A柱，從培養基的離心的上清液中純 化IgG。使用N-糖苷酶F(Roche Diagnostics GmbH, Mannheim,德國）釋放并在還原末端 用2-氨基吡啶標記純化的IgG的寡糖。通過逆向層析（HPLC)分析被標記的寡糖。通過質 譜和標準將每個峰分配給寡糖。
[0111] 葡萄糖測宙：
[0112] 使用 YSI 2700SELECT?分析儀（YSI，Yellow Springs，0H，美國），用根據生產商 手冊的方法測定葡萄糖濃度。
[0113] 活細朐密度測宙：
[0114] 使用自動圖像處理和分析系統（CEDEX?; Innovatis,德國）以及臺盼藍染 料排出方法，測定活細胞密度。
[0115] 實施例1 :DGL控制和pH對抗體生產和甘露糖-5糖基結構（M5)含量的作用
[0116] 使用生產人源化抗人IL-6受體的抗體（Tocilizumab，RoACTEMRA? )的 CHO細胞株進行測試，所述抗體是根據日本未審查專利公開號99902/1996的參照實施例 2中描述的方法，通過使用如國際專利申請公開號WO 92/19759(對應US 5, 795, 965、US 5, 817, 790和US 7, 479, 543)的實施例10中報道的人延伸因子I α啟動子制備的。
[0117] 在恒定的絕對量補料方法中，觀察到了 pH控制對免疫球蛋白生產的作用。表2顯 示了在恒定補料模式中，pH控制對抗體寡糖生產和M5含量的作用。
[0118] 表2 :pH控制在恒定絕對量補料模式中的作用
[0119]
[0120] 在pH 7. 0時，甘露糖-5糖基結構（M5)的量被調節為少于5. 5%。由于細胞密度 的改變，DGL值從0.80下降至0.21。另一方面，在pH 7.2時，M5的量在8. 7%和25. 2%之 間波動，并且高于pH 7.0時的量。pH 7. 2時的DGL值從0.73變化到0.25。此外，在此情 況下，pH 7. 2時免疫球蛋白產量大于120% (與pH 7. O時相比較的相對值）。在恒定的絕 對量補料方法中較高的免疫球蛋白生產誘導多于8%的更高的M5含量。因此，在恒定的絕 對量補料方法中，相比pH 7. 2控制方法，使用pH 7. 0控制能夠將M5含量有效地調節至較 低的值，即，低于8%。
[0121] DGL控制方法（=恒定的相對量補料方法）也用于多種pH值下的補料-分批模式 的免疫球蛋白生產，并且分析M5含量。表3顯示了在第2-3天補料開始后DGL控制和pH 對免疫球蛋白生產和M5含量的作用。
[0122] 表3 :DGL和pH控制在補料-分批模式中的作用
[0123]
[0124] 在pH 7.0時，在從0.2至0.8的DGL范圍內應用DGL控制方法。其結果是，將M5 含量調節在等于或小于4.0%。另一方面，在pH 7. 2時，操縱DGL值在從0.4至0.6的范圍 內。此時，M5含量能夠控制在小于5. 5%。
[0125] 實施例2 :用不同的DGL值培養
[0126] 用不同的DGL值實施包含編碼抗IL-6R抗體的核酸的CHO細胞的培養。結果總結 在下表4中。
[0127] 表4 :DGL控制值對免疫球蛋白生產和M5含量的作用
[0128]
[0129] 與恒定補料相比，顯示DGL值為0. 4至0. 6的受控制的DGL策略具有降低的甘露 糖-5含量。
[0130] 實施例3 :用不同的補料策略培養
[0131] 用一種DGL值，但用不同的補料策略實施包含編碼抗IL-6R抗體的核酸的CHO細 胞的培養。結果總結在下表5中。
[0132] 表5 :補料策略對活力和活細胞密度的作用
[0133]
[0134] 在單次補料實驗中，使用含有全部養分和葡萄糖的單次補料。在雙次補料實驗中， 使用兩次補料：第一次補料含有全部養分和15g/l的低濃度葡萄糖，而第二次補料含有高 濃度葡萄糖。這些不同的補料實驗以下述方式實施：在一個組中每天調整補料速率而在另 一組中遵循基于較早培養中活細胞密度發展記錄的預先確定的譜。由表5可見，活力和活 細胞密度可比較地不依賴于使用的補料策略。
[0135] 實施例4 :補料-分批模式的免疫球蛋白生產的葡萄糖限制度（DGL)控制
[0136] 如前所述，在無血清培養基中接種CHO細胞（8.0-12xl05細胞/ml)。在37°C、 98%相對濕度和10% CO2大氣壓中生長細胞。在補料-分批培養中，在從開始培養的第2 或第3天，開始向主發酵罐中補料含有葡萄糖的補料培養基。根據美國專利申請公開號US 2006/0127975 A1，補料策略遵循控制葡萄糖限制度（DGL)的方法。DGL可定義為觀察到的 比葡萄糖消耗速率與這些細胞可自由利用葡萄糖時的已知的最大比葡萄糖消耗速率的比 值（DGL = Q(glc)/Q(glc)ft大，其中Q(glc)=當前觀察到的比葡萄糖消耗速率；Q(glc)# =這些細胞最大已知的比葡萄糖消耗速率）。
[0137] 圖1顯示了培養的活細胞密度和細胞活力譜。在圖2所示的多種細胞密度中，將 DGL控制在0.4-0. 5的值。依賴于那時的細胞密度，每天改變補料速率一次或兩次。圖3顯 示了補料-分批模式的基于DGL的補料譜。根據細胞密度，補料速率在0. 8和I. 6ml/h之 間變化。用所應用的此補料對策，獲得如圖4所示的免疫球蛋白生產譜。如表6所示（補 料速率為0. 02g葡萄糖/h)，使用IOxIO5細胞/ml和12x10 5細胞/ml的接種規模，免疫球 蛋白生產幾乎相同，并且多于在恒定補料方法中第七天免疫球蛋白生產的120 %。盡管初始 細胞密度有20%的差異，使用DGL控制方法獲得幾乎相等的免疫球蛋白效價是可能的。此 外，當接種規模設定為8. OxlO5細胞/ml時，盡管補料起點的20個小時的延遲，第7天獲得 的免疫球蛋白多于110% (相對值）。在這些結果中，DGL控制方法能夠在多種接種規模實 現穩定的免疫球蛋白生產。
[0138] 實施例5 :DGL控制對甘露糖-5糖基結構和寡糖的半乳糖基化的作用
[0139] 分析使用DGL控制的補料-分批培養所生產的免疫球蛋白的糖基化模式。表6顯 示，相比恒定補料方法（補料速率：〇. 02g葡萄糖/h)，從控制DGL的補料-分批培養獲得 的免疫球蛋白的寡糖分析的結果。在8. OxlO5細胞/ml的接種規模下，甘露糖-5糖基結構 (M5)的含量是2. 8%。在IOxlO5細胞/ml和12x10 5細胞/ml的接種規模下，M5的含量分別 是4. 1%和3.8%。在全部培養條件下，DGL控制方法能夠將M5的含量調節至少于5.0%。
[0140] 同時，在每個條件下，分別將免疫球蛋白G(O)同種型和免疫球蛋白G(2)同種型控 制在從40%至46%和從9. 0%至11 %的范圍內。
[0141] 表6 :DGL控制值對免疫球蛋白生產和糖基化模式的作用
[0142]
【主權項】
1. 用于生產免疫球蛋白的方法，所述方法包括： a) 在培養基中培養包含編碼免疫球蛋白的核酸的真核細胞，其中培養基中單個細胞當 前的比葡萄糖消耗速率與該種細胞的最大已知的比葡萄糖消耗速率的比例保持恒定，和 b) 從培養物中回收免疫球蛋白。2. 根據權利要求1的方法，其特征在于比例是從0. 8至0. 2。3. 根據權利要求2的方法，其特征在于比例是從0. 6至0. 4。4. 用于生產免疫球蛋白的方法，其包括： a) 在培養基中培養包含編碼免疫球蛋白的核酸的真核細胞，其中每時間單位培養基中 可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制在少于每時間單位培養基中細胞最大能夠利用的量的 80 %的恒定值，和 b) 從培養物中回收免疫球蛋白。5. 根據權利要求4的方法，其特征在于恒定值少于80%且多于20%。6. 根據任一項前述權利要求的方法，其特征在于培養是補料-分批培養。7. 根據權利要求6的方法，其特征在于培養是補料-分批培養，其中補料在培養的第2 天或第3天開始。8. 根據任一項前述權利要求的方法，其特征在于培養在從抑6. 5至7. 5的抑值下。9. 根據權利要求8的方法，其特征在于培養在從抑6. 9至7. 3的抑值下。10. 根據權利要求9的方法，其特征在于培養在從抑6. 95至抑7. 05的抑值下或在 從抑7. 15至抑7. 25的抑值下。11. 根據任一項前述權利要求的方法，其特征在于免疫球蛋白是G類或E類免疫球蛋 白。12. 根據任一項前述權利要求的方法，其特征在于真核宿主細胞選自CK)細胞、NS0細 胞、肥K細胞、BHK細胞、雜交瘤細胞、PER.C6?細胞、昆蟲細胞和Sp2/0細胞。13. 根據權利要求12的方法，其特征在于真核細胞是中國倉鼠卵巢（CHO)細胞。14. 根據任一項前述權利要求的方法，其特征在于宿主細胞的培養實施6至20天。15. 根據任一項前述權利要求的方法，其特征在于免疫球蛋白是抗IL-6R抗體。
【專利摘要】本文報道了用于生產免疫球蛋白的方法，所述方法包括下列步驟：a)提供包含編碼免疫球蛋白的核酸的真核細胞，b)在培養基中培養真核細胞，其中每時間單位培養基中可用的葡萄糖的量保持恒定，并限制在少于每時間單位培養基中細胞最大利用的量的80％，和c)從培養物中回收免疫球蛋白。
【IPC分類】C12P21/02
【公開號】CN104928336
【申請號】CN201510397344
【發明人】R·弗蘭策, 平島親, T·林克, 高本良智, 田熊晉也, 津田祐理子
【申請人】弗·哈夫曼-拉羅切有限公司, 中外制藥株式會社
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2010年10月25日
【公告號】CA2773522A1, CN102596995A, CN102596995B, EP2493922A1, US20110117087, WO2011051231A1