用于生產糖基化免疫球蛋白的方法
【專利說明】用于生產糖基化免疫球蛋白的方法
[0001] 本申請為2010年10月25日提交的、發明名稱為"用于生產糖基化免疫球蛋白的 方法"的PCT申請PCT/EP2010/066073的分案申請，所述PCT申請進入中國國家階段的日期 為2012年4月26日，申請號為201080048412. 2。
[0002] 本文報道在細胞中生產免疫球蛋白的領域的方法，從而可以基于培養條件修飾所 生產的免疫球蛋白的糖基化模式。
[0003] 發明背景
[0004] 近年來免疫球蛋白的生產穩定增加并且在不久的將來，免疫球蛋白可能將成為多 種疾病治療可用的治療法的最大組別。免疫球蛋白的影響源自其特異性，所述特異性包括 其特異性的靶識別和結合功能以及與抗原/Fe受體結合的同時或之后特定效應的活化。
[0005] 特異性的靶識別和結合由免疫球蛋白的可變區介導。產生效應的免疫球蛋白分子 的其他部分是翻譯后修飾，例如糖基化模式。翻譯后修飾對免疫球蛋白的效力、穩定性、免 疫原性潛力、結合等確實具有影響。在此，必須提及依賴于補體的細胞毒性（CDC)、抗體依賴 性細胞毒作用（ADCC)和誘導凋亡。
[0006] 已報道免疫球蛋白的糖基化模式，即附著的糖基結構的糖組成和數量對生物 學性質具有強烈影響（參見例如 Jefferis，R· ,Biotechnol. Prog. 21(2005) 11-16)。由 哺乳動物細胞生產的免疫球蛋白含有以質量計2-3%的碳水化合物〇'&1^811(*1，1'. 等人，Biochem. 24(1985)5551-5557)。例如，在G類免疫球蛋白（IgG)中，這等價 于在小鼠來源的IgG中的2. 3個寡糖殘基（Mizuochi, T.等人，Arch. Biochem. Biophys. 257(1987)387-394)和在人來源的IgG中的2. 8個寡糖殘基（Parekh，R. 等人， Nature 316(1985)452-457)，其中一般地兩個位于Fe區而剩余的位于可變區（Saba, J. Α·等人，Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31)。
[0007] 在G類免疫球蛋白的Fe區中，能夠通過在297位的氨基酸殘基的N-糖基化引入 寡糖殘基，所述氨基酸殘基是天冬酰胺殘基（被標注為Asn297)。Youings等人展示在15% 至20 %的多克隆IgG分子的Fab區中存在其他N-糖基化位點（Youings，A.等人，Biochem. J.，314(1996)621-630 ;還參見例如，Endo, T.等人，Mol. Immunol. 32(1995)931-940)。由 于非均一的（即不對稱的）寡糖加工，存在具有不同糖基化模式的免疫球蛋白的多種同 種型（Patel, T. P.等人，Biochem. J. 285(1992)839-845 ;Ip, C. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399 ;Lund, J.等人，Mol. Immunol. 30 (1993) 741-748)。寡糖的 結構和分布都同時是高度可重現的（即，非隨機的）和位點特異性的（Dwek，R. A.等人， J.Anat. 187(1995)279-292)。
[0008] 免疫球蛋白的一些特征與Fc區的糖基化直接相關（參見例如Dwek, R.A.等 人，J. Anat. 187 (1995) 279-292 ;Lund, J.等人，J. Immunol. 157 (1996) 4963-4969 ; Lund, J. ,FASEB J. 9(1995)115-119 ； Wright,A.和 Morrison，S· L·，J· Immunol. 160 (1998) 3393-3402)，例如熱穩定性和溶解性（West，C. M，Mol. Cell.Biochem.72 (1986) 3_20)、抗原性（Turco，S.J.，Arch.Biochem. Biophys. 205 (1980) 330-339)、免疫原性（Bradshaw，J.P.等人，Biochim.Biophys. Acta 847 (1985) 344-351 ;Feizi，T.和 Childs, R. A. ,Biochem.J. 245(1987) 1-11; Schauer, R.，Adv. Exp. Med. Biol. 228 (1988) 47-72)、清除率 / 循環半壽期（Ashwell, G. 和 Harford, J.，Ann. Rev. Biochem. 51 (1982) 531-554 ;McFarlane, I. G.，Clin. Sci. 64(1983) 127-135 ；Baenziger, J. U. , Am. J. Path. 121 (1985) 382-391 ；Chan, V. T.和 Wolf, G·，Biochem. J.247(1987)53_62;Wright，A.等人，Glycobiology 10 (2000) 1347-1355 ;Rifai, A.等人，J. Exp. Med. 191 (2000) 2171-2182 ;Zukier, L. S.等人， Cancer Res. 58(1998)3905-3908)，和生物學比活性（JefTeris，R·和Lund, J·，in Antibody Engineering, Capra, J. D.編著，Chem. Tmmunol · Basel, Karger, 65 (1997) 111-128) 〇
[0009] 已研宄了影響糖基化模式的因子，例如發酵基質中存在胎牛血清 (Gawlitzek，M.等人，J.Biotechnol.42(2) (1995) 117-131)、緩沖條件（MUthing，J. 等人，Biotechnol.Bioeng. 83(2003)321-334)、溶解氧濃度（Saba, J. Α·等人，Anal. Biochem. 305 (2002) 16-31 ;Kunkel, J. Ρ·等人，J. Biotechnol. 62 (1998) 55-71 ;Lin, Α· Α·等 人，Biotechnol. Bioeng. 42 (1993) 339-350)、寡糖的位置和構象以及宿主細胞類型和細胞 生長狀態（Hahn, T. J.和 Goochee, C. F.，J. Biol. Chem. 267 (1992) 23982-23987 Jenkins, N. 等人，Nat. Biotechnol. 14 (1996) 975-981)、細胞核苷酸-糖代謝（Hills, A. E.等人， Biotechnol.Bioeng. 75(2001)239-251)、養分限制（Gawlitzek, Μ.等人，Biotechnol. Bioeng. 46 (1995) 536-544 ;Hayter，P.M.等人，Biotechnol. Bioeng. 39 (1992) 327-335)， 特別地葡萄糖限制（Tachibana，H.等人，Cytotechnology 16(1994) 151-157)，和胞外 pH(Borys，M.C.等人，Bio/Technology 11(1993)720-724)。
[0010] 通過在例如NSO骨髓瘤細胞中重組表達免疫球蛋白，已經觀察到了增加的寡聚甘 露糖結構以及截短的寡糖結構（Ip, C. C.等人，Arch. Biochem. Biophys. 308 (1994) 387-399 ; Robinson, D. K.等人，Biotechnol. Bioeng. 44 (1994) 727-735)。在葡萄糖饑餓 的條件下，已經觀察到CHO細胞、鼠3T3細胞、大鼠肝細胞瘤細胞、大鼠腎細胞 和鼠骨髓瘤細胞中的糖基化變化，例如較小的前體寡糖的附著或完全缺少寡糖 部分（Rearick，J.I.等人，J. Biol. Chem. 256 (1981)6255-6261 ;Davidson，S. Κ·和 Hunt, L. A.，J. Gen. Virol. 66 (1985) 1457-1468 ;Gershman，H. *Robbins，P. W.，J. Biol. Chem. 256 (1981) 7774-7780 ;Baumann，H. *Jahreis，G.P.，J.Biol. Chem. 258 (1983) 3942-3949 ;Strube, K. -H.等人，J. Biol. Chem. 263 (1988) 3762-3771 ; Stark, N.J.和 Heath, E.C·，Arch. Biochem. Biophys. 192 (1979) 599-609)。Wong, D.C.F.等 人，Biotechnol. Bioeng. 89 (2005) 164-177報道了基于低谷氨酰胺/葡萄糖濃度的策略。
[0011] 日本專利申請JP 62-258252報道了哺乳動物細胞的灌注培養物，而US 5, 443, 968報道了用于分泌蛋白質的細胞的補料-分批培養方法。在W098/41611中，報道了 使細胞適應特征是低乳酸生產的代謝狀態的有效的細胞培養方法。WO 2004/048556中報道 了為了生產物質而培養細胞的方法。Elbein, A. D.，Ann. Rev. Biochem. 56 (1987) 497-534 報 道了當在缺少葡萄糖的條件下孵育時，哺乳動物細胞將含有甘露糖-5的結構而非含有甘 露糖-9 的結構轉移到蛋白質。Takuma, S.等人，在 Biotechnol. Bioeng. 97 (2007) 1479-1488 中報道了在葡萄糖限制的過程中，PC02的依賴性對CHO細胞生長、代謝和IgG生產的影響。
[0012] 歷
[0013] 已發現基于培養方法中向細胞提供的葡萄糖的量，能夠修改由真核細胞生產的多 肽的糖基化模式中甘露糖-5糖基結構的量。通過降低可用的葡萄糖的量，例如通過將DGL 值從1.0 變為更小的值（例如0. 8、0. 6、0. 5、0. 4或0. 2)，能夠獲得糖基化模式中甘露糖-5 糖基結構量的改變。DGL值或每時間單位可用的葡萄糖的量必須分別保持恒定和處于每時 間單位確定的降低的值。
[0014] 本文報道的第一個方面是在真核細胞中生產多肽（在一個實施方案中是免疫球 蛋白）的方法，所述方法包括下列步驟：
[0015] a)提供包含編碼多肽的核酸的真核細胞，
[0016] b)在這樣的條件下培養細胞，其中葡萄糖限制度（DGL)保持恒定且其中DGL少于 0· 8,和
[0017] c)從培養物中回收多肽，
[0018] 其中，具有甘露糖-5糖基結構的多肽級分是包含具有甘露糖-5糖基結構的多肽 的量、多肽G(O)同種型的量、多肽G(I)同種型的量和多肽G(2)同種型的量的總和的10% 或更少。
[0019] 在一個實施方案中，DGL在從0.8至0.2的范圍內保持恒定。在其他實施方案中， DGL在從0. 6至0. 4的范圍內保持恒定。在另一個實施方案中，具有甘露糖-5糖基結構的 多肽級分是包含具有甘露糖-5糖基結構的多肽、多肽G(O)同種型、多肽G(I)同種型和多 肽G(2)同種型的總和的8%或更少。仍然在另一個實施方案中，多肽是免疫球蛋白，在一個 實施方案中是G或E類的免疫球蛋白