A1菌液與步驟1的分生孢子濃度為 I X 107cfu/mL的分生孢子懸浮液等體積混合均勻，得到混合液。吸取200 μ L混合液并使 用涂布器將其均勻的涂布于鋪有NC膜的IMAS固體培養基上，然后在26°C暗培養36小時。 培養結束后在無菌條件下將NC膜從IMAS固體培養基上轉移到DFM(潮霉素濃度為150mg/ mL，頭孢霉素濃度為300mg/mL)固體培養基上培養6-8d，待長出轉化子后再將轉化子轉移 至PDA(潮霉素濃度為150mg/mL，頭孢霉素濃度為300mg/mL)培養基中繼續培養，其構建策 略如圖3。挑選2個轉化子分別命名為Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b，其表型如圖4中A所 示。Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b是將V592菌株中的大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl 的基因（簡稱VdpdaAl基因）敲除得到的重組大麗輪枝菌。大麗輪枝菌致病性相關蛋白 VdpdaAl的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示，大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因 組基因如SEQ ID No. 3所示，大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的cDNA基因如SEQ ID No. 2所示。
[0122] 三、大麗輪枝菌VdpdaAl敲除突變體的驗證
[0123] 以V592菌株的基因組DNA為模板，以PDAl-ts和PDAl-tx為引物進行PCR擴增， 獲得V592菌株的PCR產物，將V592菌株的PCR產物（SEQ ID NO. 3中的第496位至833 位所示的核苷酸序列）作為探針DNA，參照Riboprobe Systtem-SP6探針標記試劑盒（為 Promega產品，產品目錄號為P1420)的說明書，使用a-[32P]dCTP進行探針DNA的標記。分 別提取步驟二得到的轉化子（Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b)的基因組DNA，以PDAl-ts和 PDAl-tx為引物，進行Southern雜交驗證，檢測轉化子中的VdpdaAl基因是否被敲除。
[0124] 圖4中B的結果表明，V592菌株中可雜交得到一條明亮的條帶，即VdpdaAl基因 的目的片段，而兩個敲除突變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b中在相應的位置沒有雜交出 相應的條帶，此結果說明敲除突變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b中的VdpdaAl基因已經 被敲除。
[0125] 四、VdpdaAl基因在V592菌株中的表達分析
[0126] 分別提取V592菌株的菌核、菌絲和分生孢子的RNA，并反轉錄為cDNA，分別以 cDNA為模板，以PDAl-qs和PDAl-qx為引物，進行熒光定量qRT-PCR。以β -tubline基因 (DQ266153)作為內參基因，β-tubline-f 和 β-tubline-r 作為引物。
[0127] 圖5中結果表明，VdpdaAl基因在V592菌株的分生孢子中的轉錄水平明顯高于在 菌絲和菌核中的轉錄水平，在菌絲中的轉錄水平最低，表明VdpdaAl基因在V592菌株中的 表達具有組織特異性。
[0128] 五、大麗輪枝菌VdpdaAl敲除突變體的生物學性狀
[0129] 首先將步驟二獲得的大麗輪枝菌VdpdaAl敲除突變體Λ VdpdaAl-a和 Λ VdpdaAl-b分別移植到普通PDA培養基上，在26°C培養10d，然后分別對各菌株進行下述 生物學特性的觀察和測定，以V592菌株為對照。
[0130] 1、培養性狀觀察
[0131] 用打孔器在菌株菌落邊緣打取直徑為Icm的菌餅，將菌餅接種于PDA培養基平板 中央，在26°C暗培養10d，根據突變菌株的菌落形態和黑色微菌核的多少等特征對突變菌 株進行表型類型分類，分類標準參考文獻：彭姍，呂學蓮，高峰等.一種新的棉花黃、枯萎病 快速接種方法的研宄[J].棉花學報，2008, 20(3) : 174~178。結果如圖6中A，表明敲除突 變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b在PDA培養基上的表型均為菌核型，在培養基的正面和 背面都產生黑色的微菌核，與V592菌株沒有明顯的差異。
[0132] 2、菌落生長速度測定
[0133] 用打孔器在菌株菌落邊緣打取直徑為Icm的菌餅，將菌餅接種于PDA培養基平板 中央，26°C暗培養，用十字交叉法測量各菌株的菌落直徑，從第三天到第九天每天測量一次 菌落直徑，共測7次，每個菌株設三個重復，每種菌株每次的菌落直徑是其三個重復的平均 值，菌落生長速度=(第九天直徑-第五天直徑）+4。
[0134] 菌落生長速度測定結果顯示：
[0135] A.在普通PDA培養基平板上，V592菌株的生長速度為3. 667mm/d，敲除突變體 Λ VdpdaAl-a 和Λ VdpdaAl-b 的分別為 3. 81mm/d、3. 82mm/d，敲除突變體Λ VdpdaAl-a 和 Λ VdpdaAl-b的菌落生長速度要比野生型菌株的菌落生長速度快。
[0136] B. V592菌株在第九天時的菌落直徑為37mm，敲除突變體Λ VdpdaAl-a和 Λ VdpdaAl-b的分別為38mm、38mm，與V592菌株差異不顯著。
[0137] 3、產孢量測定
[0138] 用打孔器在菌株菌落邊緣打取10個直徑為Icm的菌餅，將菌餅接種于裝有查氏液 體培養基的錐形瓶中，在26°C、200rpm條件下搖培5天，用無菌的微孔濾布過濾培養物至無 菌的離心管中，再用250mL超純水洗錐形瓶并用微孔濾布過濾至新的無菌離心管中，收集 分生孢子。將收集的分生孢子在4°C、1200rpm條件下離心30分鐘，棄上清，用IOmL超純水 重新懸浮沉淀，轉移至無菌離心管，在4°C、1200rpm條件下離心30分鐘，棄上清，收集沉淀， 獲得分生孢子。用無菌水將收集的分生孢子濃度調至IX 106cfu/mL，然后準確吸取ImL分 生孢子懸浮液，接種至裝有IOOmL查氏液體培養基的150mL的三角瓶中，在26°C，200rpm條 件下暗培養。在顯微鏡下用血球計數板測量分生孢子濃度，從第二天到第九天每24h測量1 次分生孢子濃度，共測8次，每個菌株設三個重復，每種菌株每次的分生孢子濃度是其三個 重復的平均值。
[0139] 結果表明從第三天開始，敲除突變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b的產孢量均明 顯低于V592菌株（圖6中B)，敲除突變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b在各個檢測時間點 的產孢量沒有顯著差異，這表明VdpdaAl基因與分生孢子產量相關，VdpdaAl基因參與了分 生孢子的形成。
[0140] 4、分生孢子和菌絲形態觀察
[0141] 分生孢子形態觀察：收集同一時期相同培養條件下敲除突變體Λ VdpdaAl-a、 Λ VdpdaAl-b和V592菌株的分生孢子在顯微鏡下觀察，以V592菌株為對照，觀察敲除突變 體的分生孢子與V592菌株之間的差異。
[0142] 分生孢子形態觀察結果：敲除突變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b的分生孢子形 態多為橢圓形，大多數里面有油滴，與V592菌株相比沒有差異。
[0143] 菌絲形態觀察：采用小室培養的方法（載玻片培養法），對菌株菌絲的形態進行觀 察，即用滅菌的牙簽在菌株菌落邊緣打取直徑約為5_的菌餅，倒置放在無菌的載玻片上， 將載玻片置于保濕的培養皿內，26°C暗培養3天，取出載玻片在顯微鏡下觀察敲除突變體 的菌絲與V592菌株的菌絲微觀結構。
[0144] 結果表明在保濕的培養皿中培養3天之后，敲除突變體Λ VdpdaAl-a和 Λ VdpdaAl-b形成的分生孢子梗明顯比V592菌株分生孢子梗少（圖6中C)。
[0145] 5、顯微觀察敲除突變體分生孢子的萌發情況
[0146] 將敲除突變體Λ VdpdaAl_a、A VdpdaAl-b和V592菌株的菌餅分別接種在查氏培 養基中，在26°C、200rpm的搖床中培養24h，用無菌的濾布收集分生孢子懸浮液，用移液槍 吸取定量的分生孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察分生孢子萌發的情況。
[0147] 結果表明，V592菌株與敲除突變體Λ VdpdaAl-a和Λ VdpdaAl-b的分生孢子萌發 并沒有明顯差異（圖7)。
[0148] 6、致病性測定
[0149] 采用棉花苗期灌根法對各菌株進行致病性的鑒定。將需要進行致病力分析的菌株 預先用查氏液體培養基，在26°C，200rpm條件下培養1周。棉苗生長至出現2片真葉時，將 準備好的分生孢子濃度為I X IO7個/mL的菌株分生孢子液進行灌根接種處理。每個盆缽約 200mL，分生孢子懸浮液沿著棉苗莖基部輕輕倒入培養基質中。每個菌株設2個重復。接種 35天后，對接種棉株進行發病癥狀拍照和調查。按以下標準記載發病級別，O級：沒有葉片 發病的植株；1級：〇. 1% _25%的葉片發病的植株；2級：25% -50%的葉片發病的植株，不 包括25%的葉片發病；3級：50% -75%葉片的發病的植株，不包括50%的葉片發病；4級： 大于75%的葉片發病的植株。不同菌株處理的植株病情指數被用來評價菌株致病力程度。 結果表明，在接種24天后，接種V592菌株的棉花葉片開始出現萎蔫、焦枯，大約接種35天 后接種V592菌株的棉花萎蔫枯死，而接種敲除突變體Λ VdpdaAl-a或Λ VdpdaAl-b的植株 生長旺盛（圖8)，接種V592菌株的棉花、接種敲除突變體Λ VdpdaAl-a棉花和接種敲除突 變體Λ VdpdaAl-b棉花在接種35天后的病情指數分別為75. 94%、10. 00%和11. 05%，表 明VdpdaAl基因是V592菌株致病的一個關鍵因子。<