大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaA1的用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域中大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的用途。
【背景技術】
[0002] 棉花黃萎病是一種土傳的維管束系統病害，是由大麗輪枝菌引起的，其對棉花的 生產造成了嚴重的危害。自1935年，棉花黃萎病隨著棉花種子的引進而傳入我國，隨后便 開始逐漸蔓延全國。尤其從20世紀90年代以后，棉花黃萎病在我國擴展蔓延極為迅速，其 中1993年棉花黃萎病最為嚴重，發病面積達266. 67萬hm2,隨后在1995、1996、1999、2000、 2002、2003年全國范圍內連續爆發，損失十分嚴重，棉花黃萎病已對我國棉花生產以及可持 續發展構成極大威脅。
[0003] 棉花黃萎病是由半知菌亞門（Deutermycotina)淡色菌科（Mmonilaceae)輪 枝菌屬（Verticillium)真菌引起，屬內有若干個種，其中危害棉花的有大麗輪枝菌 (V. dahliae)和黑白輪枝菌（V. albo-atum)兩個種。我國棉花黃萎病主要是由大麗輪枝菌 引起的。大麗輪枝菌沒有寄主專化性，可以危害多種植物，從一年生的草本植物到多年生的 木本植物。大麗輪枝菌可以形成一種叫做黑色微菌核的休眠結構，可以在缺乏寄主的土壤 中存活長達數年。
[0004] 大麗輪枝菌主要以微菌核的形式越冬，微菌核作為其最主要的初侵染來源，在受 到植物根部分泌物的刺激時便會萌發。菌絲一般從植物根部侵入，隨著植物的蒸騰作用向 植物的莖葉中擴展、定植，最終侵染整個植株。一般被大麗輪枝菌侵染過的植株都會表現出 萎蔫，干枯，葉脈失色，壞死等癥狀，維管束變褐是黃萎病最典型的癥狀。
[0005] 田黎等的研宄認為棉花黃萎病的發生發展與土壤中微菌核的數量密切相關。大麗 輪枝菌微菌核的多少通常與其致病力和抗逆性相關。有研宄顯示，當土壤里棉花黃萎菌微 菌核達到〇. 03個/g 土時，就會導致棉花出現萎蔫癥狀，當土壤中微菌核含量達到0. 3個/g 土~I. 0個/g 土時，就會有20 %~50%的棉花植株發病，當土壤中微菌核含量達到3. 5個 /g 土以上，棉花植株都會發病。另有研宄表明，當土壤中微菌核含量達到0. 5個/g 土為引 起棉花發病的臨界值。在田里面，當黃萎菌侵染萵苣后，土壤中的微菌核數量為至少50個 /g 土，而病害很重的田塊，微菌核數目高達2400個/g 土。
[0006] 棉花是目前世界上種植面積最大的工業原料作物，在我國是僅次于糧食的第二大 農作物。棉花黃萎病是目前我國棉花生產過程中最具毀滅性的真菌病害。由于至今尚未研 制出效果顯著的防治藥劑和抗病品種，被稱為棉花的"癌癥"，因此如何控制黃萎病的猖獗 危害，已成為棉花生產可持續發展的關鍵問題。在這種情況下，研宄大麗輪枝菌的致病機 理，了解大麗輪枝菌與寄主的互作機理就顯得更為重要。
【發明內容】
[0007] 本發明所要解決的技術問題是提供一種大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl或 其基因。
[0008] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了一種制備致病性降低和/或分生孢子產 量降低的重組大麗輪枝菌的方法。
[0009] 本發明所提供的一種制備致病性降低和/或分生孢子產量降低的重組大麗輪枝 菌的方法，是抑制目的大麗輪枝菌中大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因的表達， 得到致病性低于所述目的大麗輪枝菌的重組大麗輪枝菌和/或分生孢子產量低于所述目 的大麗輪枝菌的重組大麗輪枝菌；
[0010] 所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl為a)或b):
[0011] a)氨基酸序列是SEQ ID No. 1所示的蛋白質；
[0012] b)將SEQ ID No. 1所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺 失和/或添加得到的具有大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl活性的由a)衍生的蛋白質。
[0013] 其中，SEQ ID No. 1由247個氨基酸殘基組成。
[0014] 上述b)中所述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10 個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
[0015] 上述b)中所述蛋白質可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得 到。
[0016] 上述b)中所述蛋白質的編碼基因可通過將SEQ ID No. 2所示的DNA序列中缺失 一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變得到的。
[0017] 上述方法中，所述致病性降低的重組大麗輪枝菌對植物的致病性低于所述目的大 麗輪枝菌；所述目的大麗輪枝菌為含有所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因的 大麗輪枝菌，如大麗輪枝菌野生型菌株V592。
[0018] 上述方法中，所述分生孢子產量降低的重組大麗輪枝菌的分生孢子產量低于所述 目的大麗輪枝菌；所述目的大麗輪枝菌為含有所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的 基因的大麗輪枝菌，如大麗輪枝菌野生型菌株V592。
[0019] 上述方法中，所述抑制目的大麗輪枝菌中所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白 VdpdaAl的基因的表達是通過將所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因敲除的方 式實現的。
[0020] 上述方法中，所述基因敲除可通過同源重組實現。
[0021] 本發明提供的利用所述制備致病性降低和/或分生孢子產量降低的重組大麗輪 枝菌的方法獲得的致病性降低和/或分生孢子產量降低的重組大麗輪枝菌也屬于本發明 保護的范圍。
[0022] 本發明所提供的抑制所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl表達的物質、抑制 所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因表達的物質或降低所述大麗輪枝菌致病 性相關蛋白VdpdaAl活性的物質在培育抗大麗輪枝菌植物中的應用也屬于本發明保護的 范圍。
[0023] 上述應用中，所述抗大麗輪枝菌植物可為轉基因植物。
[0024] 上述應用中，所述植物可為大麗輪枝菌的寄主；所述大麗輪枝菌的寄主可為雙子 葉植物或單子葉植物；所述雙子葉植物可為棉花、番茄、向日葵、黃瓜等；所述單子葉植物 可為水稻、玉米、高粱、麥類、谷子等；所述大麗輪枝菌的寄主具體可為棉花。
[0025] 本發明所提供的抑制所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl表達的物質、抑制 所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因表達的物質或降低所述大麗輪枝菌致病 性相關蛋白VdpdaAl活性的物質在制備大麗輪枝菌抑制劑中的應用也屬于本發明保護的 范圍。
[0026] 上述應用中，所述大麗輪枝菌抑制劑可通過所述大麗輪枝菌致病性相關的蛋白 VdpdaAl或所述大麗輪枝菌致病性相關的蛋白VdpdaAl的基因為革El點進行篩選。
[0027] 上文中，所述抑制大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因表達的物質可為干 擾所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的基因表達的物質，如microRNA、VdpdaAl的基 因的反義基因表達的RNA。
[0028] 本發明還提供了所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl，或所述大麗輪枝菌致 病性相關蛋白VdpdaAl相關的生物材料在調控大麗輪枝菌致病性和/或大麗輪枝菌分生孢 子產量中的應用；
[0029] 所述大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl相關的生物材料為下述Al)至A20)中 的任一種：
[0030] Al)核酸分子；所述核酸分子為編碼大麗輪枝菌致病性相關蛋白VdpdaAl的核酸 分子；
[0031] A2)含有Al)所述核酸分子的表達盒；
[0032] A3)含有Al)所述核酸分子的重組載體；
[0033] A4)含有A2)所述表達盒的重組載體；
[0034] A5)含有Al)所述核酸分子的重組微生物；
[0035] A6)含有A2)所述表達盒的重組微生物；
[0036] A7)含有A3)所述重組載體的重組微生物；
[0037] A8)含有A4)所述重組載體的重組微生物；
[0038] A9)含有Al)所述核酸分子的轉基因植物細胞系；
[0039] A10)含有A2)所述表達盒的轉基因植物細胞系；
[0040] All)含有A3)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0041] A12)含有A4)所述重組載體的轉基因植物細胞系；
[0042] A13)含有Al)所述核酸分子的轉基因植物組織；
[0043] A14)含有A2)所述表達盒的轉基因植物組織；
[0044] A15)含有A3)所述重組載體的轉基因植物組織；
[0045] A16)含有A4)所述重組載體的轉基因植物組織；
[0046] A17)含有Al)所述核酸分子的轉基因植物器官；
[0047] A18)含有A2)所述表達盒的轉基因植物器官；
[0048] A19)含有A3)所述重組載體的轉基因植物器官；
[0049] A20)含有A4)所述重組載體的轉基因植物器官。
[0050] 上述應用中，所述調控大麗輪枝菌致病性可為降低大麗輪枝菌的致病性。
[0051] 上述應用中，所述調控大麗輪枝菌分生孢子產量可為降低大麗輪枝菌分生孢子產 量。
[0052] 上述應用中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因組DNA或重組DNA ;所述核酸 分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
[0053] 所述核酸分子為如下1)-5)中任一所示的基因：
[0054] 1)其編碼序列是SE