形物質(zhì)量的1.5%加入中性蛋白酶，在50 °C酶解4 h，冷卻至20°C，然后于6000 rpm離心25min，除去沉淀物，得到酶解液；
3)帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得到超濾酶解液，將超濾酶解液按照體積比加入到裝有10倍D201大孔樹脂的層析柱中，用5倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用8倍柱體積的30%乙醇進(jìn)行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)陽離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚肉蛋白抗氧化肽，利用氨基酸序列分析儀和質(zhì)譜測定其結(jié)構(gòu)，具體過程為:
①陽離子交換層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為45mg/mL的溶液，經(jīng)過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(732)層析柱分離，收集雙蒸水洗脫組分，即為離子交換層析酶解物；
②凝膠色譜層析:將上述離子交換層析酶解物用雙蒸水配成濃度為20mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)230 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高羥基自由基清除活性的峰為凝膠層析酶解物F3 (圖1)。
[0019]③高效液相色譜精制:將上述凝膠層析酶解物(F3)用雙蒸水配成濃度為80 μ g/mL的溶液，用RP-HPLC進(jìn)行純化(進(jìn)樣量20 yL ;色譜柱Kromasil C18 (250 mmX4.6 mm, 5μπι);流動(dòng)相40%乙腈；紫外檢測波長230 nm)，根據(jù)230 nm下的吸光度曲線和羥基自由基清除活性得I個(gè)高活性抗氧化肽(圖2)。
[0020]④結(jié)構(gòu)檢測:收集羥基自由基清除活性最高的I個(gè)抗氧化肽，經(jīng)RP-HPLC檢測為單一峰，利用蛋白/多肽序列分析儀測定氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp(NWDMEKIW)，ES1-MS 測定分子量為 1121.25 Da ([M+H]+ 1122.23)(圖 3)。
[0021]將制得的帶魚魚肉蛋白抗氧化肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp(NWDMEKIff)進(jìn)行自由基清除實(shí)驗(yàn)和脂質(zhì)過氧化抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp (NWDMEKIW)對(duì) DPPH 自由基(EC50 1.37 mg/mL)、羥基自由基(EC5tl 0.172 mg/mL)和超氧陰離子自由基(EC5tl 0.083 mg/mL)具有良好的清除作用；同時(shí)，Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp (NWDMEKIff)亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為八肽化合物，氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1Ie-Trp, ES1-MS 測定分子量為 1121.25 Da02.如權(quán)利要求1所述的帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括下述步驟: 1)帶魚魚肉預(yù)處理:取帶魚魚肉用高速組織搗碎機(jī)處理成勻漿，加熱至80~100°C后保溫5~10min，然后按照料液比lg:2~4mL加入異丙醇，于20~25°C脫脂18~24 h，然后于4°C、4500-6000 rpm離心15~20min除去異丙醇，收集脫脂帶魚魚肉固形物； 2)帶魚魚肉蛋白的酶解:將上述脫脂帶魚魚肉固形物按固液比lg:20~25mL加入濃度為0.05 mol/L，pH 6.5-7.5的磷酸鹽緩沖液，然后將混合液溫度升至55~65°C攪拌預(yù)熱10~15 min，按脫脂帶魚魚肉固形物質(zhì)量的1.0-1.5%加入protamex復(fù)合蛋白酶，在55~65°C酶解4~6 h ;然后將酶解液升溫至90~95°C后恒溫保持10~15 min，將酶解液溫度降至45~50 0C，按脫脂帶魚魚肉固形物質(zhì)量的1.5~2.0%加入中性蛋白酶，在45~50 °C酶解3~5h，冷卻至20~25°C，然后于5000~6000 rpm離心20~25min，除去沉淀物，得到酶解液； 3)帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3kDa超濾膜進(jìn)行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得到超濾酶解液，將超濾酶解液按照體積比加入到裝有8?10倍D201大孔樹脂的層析柱中，用3?5倍柱體積水洗脫除去雜質(zhì)，然后用5?8倍柱體積的30%乙醇進(jìn)行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經(jīng)陽離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜純化，得到帶魚魚肉蛋白抗氧化肽。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于步驟I)中所述的帶魚為日本帶魚(Trichiurus japonicus)。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于所述步驟3)的陽離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為: 陽離子交換樹脂層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為45~50 mg/mL的溶液，經(jīng)過強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂(732)層析柱分離，收集雙蒸水洗脫組分，即為離子交換層析酶解物； 凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為15~20 mg/mL的溶液，經(jīng)過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進(jìn)行洗脫，根據(jù)230 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高羥基自由基清除活性的峰為凝膠層析酶解物； RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進(jìn)行純化，流動(dòng)相為40%乙腈，洗脫速度0.8-1.0 mL/min，紫外檢測波長230 nm),根據(jù)對(duì)輕基自由基的清除活性得I個(gè)高抗氧化活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp。5.權(quán)利要求1所述的一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽用于制備抗氧化藥物和保健品的用途。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用途，具體講是以帶魚魚肉為原料，通過脫脂、protamex復(fù)合蛋白酶和中性蛋白酶雙酶酶解得酶解液，酶解液采用超濾、大孔樹脂純化、陽離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜分離純化得到抗氧化肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-Ile-Trp，ESI-MS測定分子量為1121.25 Da。本發(fā)明制備的高活性抗氧化肽對(duì)DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時(shí)，亦顯示出良好的脂質(zhì)過氧化抑制作用。具有安全無毒副作用、抗氧化活性強(qiáng)和易于消化吸收等優(yōu)點(diǎn)，可以作為藥品、保健食品或食品添加劑等。
【IPC分類】A61P39/06, C12P21/06, A23L1/29, C07K1/36, C07K1/20, C07K1/34, C07K1/16, A61K38/08, C07K7/06, C07K1/18, A23L1/305
【公開號(hào)】CN104926925
【申請?zhí)枴緾N201510117782
【發(fā)明人】王斌, 遲長鳳, 鄧尚貴, 孫坤來, 陳蔭
【申請人】浙江海洋學(xué)院
【公開日】2015年9月23日
【申請日】2015年3月18日