一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001]本發明涉及到蛋白抗氧化肽，具體指涉及一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽及其制備方法。
【背景技術】
[0002]抗氧化劑是一類可以減弱或者祛除自由基對人體損害和保護食品免受氧化損傷變質的一類物質。目前，化學合成抗氧化劑由于價格便宜，被廣泛地應用到食品工業中。但是，化學合成抗氧化劑，如丁基羥基茴香醚(BHA)、二丁基羥基甲苯(BHT)、沒食子酸丙酯(PG)、叔丁基對苯二酚(TBHQ)等，在不同程度上損傷人體的肝臟、腎臟等器官。因此，部分國家和地區已經明確限量或禁止使用對人體有毒副作用的化學合成抗氧化劑。尋找高效、安全的天然抗氧化劑替代化學合成抗氧化劑成為研宄熱點，而抗氧化肽由于其食用安全、利用度高、無毒副作用等優點受到廣泛重視。
[0003]帶魚又叫刀魚、裙帶、肥帶、油帶、牙帶魚等，屬于脊索動物、脊椎動物亞門、硬骨魚綱、鱸形目、帶魚科，主要分布于西太平洋和印度洋，在我國的黃海、東海、渤海和南海均有分布。帶魚富含脂肪、蛋白質、維生素A、不飽和脂肪酸、微量元素等多種營養成分，具有暖胃、澤膚、補氣、養血、健美以及強心補腎、舒筋活血、消炎化痰、清腦止瀉、消除疲勞、提精養神之功效。
[0004]但是，申請人發現，以帶魚魚肉為原料，利用酶解技術制備帶魚魚肉抗氧化肽的工藝研宄處于空白階段，而以酶解產物為材料制備高活性抗氧化肽及其應用更是未見報道。
【發明內容】
[0005]本發明所要解決的技術問題是針對現有技術的現狀提供一種能夠清除自由基和抑制脂質過氧化作用的帶魚魚肉蛋白抗氧化肽，其可作為藥品、保健食品和食品的安全添加劑。
[0006]本發明所要解決的另一個技術問題是提供一種帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法。
[0007]本發明解決上述技術問題所采用的技術方案為:該帶魚魚肉蛋白抗氧化肽，其特征在于該抗氧化肽為八肽化合物，氨基酸序列為Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp(NWDMEKIff)，ES1-MS 測定分子量為 1121.25 Da。
[0008]上述帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法，其特征在于包括下述步驟:
1)帶魚魚肉預處理:取帶魚魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至80~100°C后保溫5~10min，然后按照料液比lg:2~4mL加入異丙醇，于20~25°C脫脂18~24 h，然后于4°C、4500-6000 rpm離心15~20min除去異丙醇，收集脫脂帶魚魚肉固形物；
2)帶魚魚肉蛋白的酶解:將上述脫脂帶魚魚肉固形物按固液比lg:20~25mL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L，pH 6.5~7.5)，混合液溫度升至55~65°C攪拌預熱10~15 min，按脫脂帶魚魚肉固形物質量的1.0-1.5%加入protamex復合蛋白酶，在55~65°C酶解4~6 h ;然后將酶解液升溫至90~95°C后恒溫保持10~15 min，將酶解液溫度降至45~50°C，按脫脂帶魚魚肉固形物質量的1.5-2.0%加入中性蛋白酶，在45~50°C酶解3~5 h，冷卻至20~25°C，于5000~6000 rpm離心20~25min，除去沉淀物，得到酶解液；
3)帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備:將上述酶解液采用3 kDa超濾膜進行超濾處理，收集分子量小于3 kDa部分，得到超濾酶解液，將超濾酶解液按照體積比加入到裝有8?10倍D201大孔樹脂的層析柱中，用3?5倍柱體積水洗脫除去雜質，然后用5?8倍柱體積的30%乙醇進行洗脫，乙醇洗脫液于50 V以下低壓旋蒸除去乙醇、冷凍干燥得多肽混合物，多肽混合物依次經陽離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和反相高效液相色譜(RP-HPLC)純化，得到帶魚魚肉蛋白抗氧化肽。
[0009]作為優選，所述的步驟I)中的帶魚為日本帶魚(cAitf/YAs japonicus)。
[0010]作為優選，所述步驟4)的陽離子交換樹脂層析、凝膠柱層析和RP-HPLC純化的具體過程為:
陽離子交換樹脂層析:將上述多肽混合物溶于雙蒸水配成濃度為45~50 mg/mL的溶液，經過強酸性陽離子交換樹脂(732)層析柱分離，收集雙蒸水洗脫組分，即為離子交換層析酶解物；
凝膠柱層析:將上述離子交換層析酶解物溶于雙蒸水配成濃度為15~20 mg/mL的溶液，經過葡聚糖凝膠Sephadex G-25柱層析分離，用雙蒸水進行洗脫，根據230 nm下的吸光度曲線收集洗脫組分，其中，具有最高羥基自由基清除活性的峰為凝膠層析酶解物；
RP-HPLC純化:將上述凝膠層析酶解物用雙蒸水配成80~100 μ g/mL的溶液，利用RP-HPLC進行純化，根據對羥基自由基的清除活性得I個高抗氧化活性多肽Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp (NWDMEKIff)。
[0011]再優選，所述RP-HPLC條件為:進樣量10~15 μ L ;色譜柱Kromasil C18 (250mmX4.6 mm, 5 μ m);流動相:40%乙腈；洗脫速度0.8-1.0 mL/min ;紫外檢測波長230 nm。
[0012]與現有技術相比，本發明所提供的帶魚魚肉蛋白抗氧化肽對DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基具有良好的清除作用；同時，Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp(NWDMEKIff)亦顯示出良好的脂質過氧化抑制作用；Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1Ie-Trp(NWDMEKIff)具有安全無毒副作用、抗氧化活性強和易于消化吸收等優點，可以作為藥品、保健食品和食品的添加劑。
【附圖說明】
[0013]圖1是本發明的葡聚糖凝膠Sephadex G_25層析圖。
[0014]圖2葡聚糖凝膠S印hadex G-25制備酶解物的RP-HPLC分析。
[0015]圖 3 Asn-Trp-Asp-Met-Glu-Lys-1le-Trp 的質譜圖。
【具體實施方式】
[0016]以下結合附圖實施例對本發明作進一步詳細描述。
[0017]帶魚魚肉蛋白抗氧化肽的制備方法，制備工藝流程如下:帶魚魚肉〃脫脂〃酶解〃酶解物"超濾"大孔樹脂純化"陽離子交換層析"凝膠過濾層析"高效液相色譜制備"抗氧化肽。
[0018]具體步驟為:
1)帶魚魚肉預處理:取日本帶魚(Trichiurusjaponicus)魚肉用高速組織搗碎機處理成勻漿，加熱至85°C后保溫lOmin，然后按照料液比lg:4 mL加入異丙醇，于25°C脫脂24h，然后于4°C、6000 rpm離心15 min除去異丙醇，收集脫脂帶魚魚肉固形物；
2)帶魚魚肉蛋白的酶解:將上述脫脂帶魚魚肉固形物按固液比lg:25mL加入磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L, pH 7.0)，混合液溫度升至60°C攪拌預熱10 min，按脫脂帶魚魚肉固形物質量的1.5%加入protamex復合蛋白酶，在60°C酶解4~6 h ;然后將酶解液升溫至95°C后恒溫保持15 min，將酶解液溫度降至50°C，按脫脂帶魚魚肉固