DH5 α為寶生物工程（大連）有限 公司，目錄號為9057。
[0058] 下述實施例中的大腸桿菌Escherichia coli BW25113為Biovector中國質粒載 體菌株細胞株基因保藏中心產品。
[0059] 下述實施例中的大腸桿菌Escherichia coli S17-1為Biovector中國質粒載體 菌株細胞株基因保藏中心產品。
[0060] 下述實施例中的類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1為美國模式菌種收 集中心（ATCC)產品，菌株號為17023。
[0061] 下述實施例中的Sistrom培養基在文獻（Sistrom WR. The kinetics of the synthesis of photopigments in Rhodopseudomonas sphaeroides. J.Gen. Microbiol. 1962.28:607-616)中報道過。
[0062] 下述實施例中的LB液體培養基為由溶質和溶劑組成無菌培養基，溶劑為水，溶質 及其濃度分別為胰蛋白胨lg/l〇〇mL，酵母浸粉0. 5g/100mL，NaCl 0. 5g/100mL ;
[0063] LB+kan液體培養基為向LB液體培養基中加入卡那霉素得到的無菌培養基， LB+kan液體培養基中卡那霉素的含量為50mg/L ;
[0064] LB平板為向LB液體培養基中加入瓊脂得到的無菌固體培養基；
[0065] LB+kan平板為向LB液體培養基中加入瓊脂和卡那霉素得到的無菌固體培養基， LB+kan平板中卡那霉素的含量為50mg/L。
[0066] 實施例1、溫度敏感載體的制備
[0067] 1、溫度敏感載體的篩選
[0068] 對寬宿主載體pBBRlMCS-2(圖1)中SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA 片段進行隨機突變，得到多條不同隨機突變的突變后的DNA分子；將pBBRlMCS-2中SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段分別替換為上述各突變后的DNA分子，保持 pBBRlMCS-2的其他序列不變，得到多個含有突變DNA片段的重組載體；將這些含有突變DNA 片段的重組載體分別導入大腸桿菌Escherichia coli Tl中，得到1068個含有突變DNA片 段的重組大腸桿菌。將pBBRlMCS-2導入大腸桿菌Escherichia coli Tl中，得到重組大腸 桿菌 Tl (pBBRlMCS-2)。
[0069] 其中，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸編碼SEQ ID No. 2所示的r印蛋白。 [0070] 對上述含有突變DNA片段的重組大腸桿菌按照下述方法進行篩選，并將 Tl (PBBR1MCS-2)作為對照：將這1068個重組大腸桿菌中的每個重組大腸桿菌的同 一克隆分別進行①和②的處理：①將重組大腸桿菌接種至LB平板上，于42 °C下培養 18h，然后將LB平板上42°C下長出的重組大腸桿菌接種至LB+kan平板上，于42°C下 培養18h;②將重組大腸桿菌接種至LB+kan平板上，于30°C下培養18h。對比42°C 和30 °C下的LB+kan的平板，發現有4株重組大腸桿菌在30 °C下的LB+Kan平板上生 長正常，但在42°C下的LB+Kan平板上不能生長（表1)，而Tl(pBBRlMCS-2)在30°C下 的LB+Kan平板與42°C下的LB+Kan平板上均能正常生長，表明，這4株重組大腸桿菌對 溫度敏感。將這4株重組大腸桿菌中從pBBRlMCS-2突變而來的重組載體分別命名為 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4,將對應的重組大 腸桿菌分別命名為 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)和 Tl (pBBRlMCS-2-Ts4)。
[0071] 表1、重組大腸桿菌的篩選
[0072]
[0073] 提取 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts3)和 Tl(pBBRlMCS-2-Ts4)中的 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 質粒，分別對 pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4對應于SEQ ID No. 1的第1557-2526位核苷酸所示的DNA片段進行測序， 發現：
[0074] pBBRlMCS-2-Tsl 為將 pBBRlMCS-2 進行如下 B11)、B12)、B13)和 B14)的改造并保 持pBBRlMCS-2的其他序列不變得到的重組載體，pBBRlMCS-2-Tsl的第1557-2526位核苷 酸序列為SEQ ID No. 3 :
[0075] BI 1)將 SEQ ID No. 1 第 1827 位的 G 突變為 A ;
[0076] B12)將 SEQ ID No. 1 第 2034 位的 G 突變為 C ;
[0077] B13)將 SEQ ID No. 1 第 2212 位的 A 突變為 T ;
[0078] B14)將 SEQ ID No. 1 第 2249 位的 C 突變為 A。
[0079] pBBRlMCS-2-Ts2 為將 pBBRlMCS-2 進行如下 B2)、C21)和 C22)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不變得到的重組載體，pBBRlMCS-2-Ts2的第1557-2526位核苷酸序 列為 SEQ ID No. 5 :
[0080] B2)將 SEQ ID No. 1 第 2183 位的 C 突變為 G ;
[0081] C21)將 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突變為 G ;
[0082] C22)將 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突變為 T ;
[0083] pBBRlMCS-2-Ts3 為將 pBBRlMCS-2 進行如下 B3)、C31)和 C32)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不變得到的重組載體，pBBRlMCS-2-Ts3的第1557-2526位核苷酸序 列為 SEQ ID No. 7 :
[0084] B3)為將 SEQ ID No. 1 第 2049 位的 C 突變為 T ;
[0085] C31)將 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突變為 T ;
[0086] C32)將 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突變為 A ;
[0087] pBBRlMCS-2-Ts4 為將 pBBRlMCS-2 進行如下 B41)、B42)和 C4)的改造并保持 pBBRlMCS-2的其他序列不變得到的重組載體，pBBRlMCS-2-Ts4的第1557-2526位核苷酸序 列為 SEQ ID No. 9 :
[0088] B41)將 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突變為 G ;
[0089] B42)將 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突變為 G ;
[0090] C4)將 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突變為 A。
[0091] 表明，與 pBBRlMCS-2 相比，pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4均發生了部分核苷酸的突變。
[0092] 在 1068 個重組大腸桿菌中除 Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)、Tl (pBBRlMCS-2-Ts2)、 Tl (pBBR1MCS-2-Ts3)和 Tl (pBBR1MCS-2-Ts4)外的重組大腸桿菌（在 30°C 下的 LB+Kan 平 板與42°C下的LB+Kan平板上均能正常生長，即對溫度不敏感的重組大腸桿菌）中隨機選 取10株，對這10株中從pBBRlMCS-2突變而來的重組載體進行測序，結果發現，這10株對 溫度不敏感的重組大腸桿菌中從PBBR1MCS-2突變而來的重組載體也均發生了部分核苷酸 的突變。
[0093] 與pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Tsl的第1794-2456位核苷酸編碼的蛋白質（氨 基酸序列為SEQ ID No. 4)為將SEQ ID No. 2所示的蛋白質進行如下All)、A12)和A13)的 改造得到的蛋白質：
[0094] All)將 SEQ ID No. 2 第 12 位的 Ala 突變為 Thr ;
[0095] A12)將 SEQ ID No. 2 第 81 位的 Asp 突變為 His ;
[0096] A13)將 SEQ ID No. 2 第 140 位的 His 突變為 Leu。
[0097] 與pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts2的第1794-2456位核苷酸編碼的蛋白質（氨 基酸序列為SEQ ID No. 6)為將SEQ ID No. 2所示的蛋白質進行如下A2)的改造得到的蛋 白質：A2)為將SEQ ID No. 2第130位的His突變為Gin。
[0098] 與pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts3的第1794-2456位核苷酸編碼的蛋白質（氨 基酸序列為SEQ ID No. 8)為將SEQ ID No. 2所示的蛋白質進行如下A3)的改造得到的蛋 白質：A3)為將SEQ ID No. 2第86位的Arg突變為Cys。
[0099] 與pBBRlMCS-2相比，pBBRlMCS-2-Ts4的第1794-2456位核苷酸編碼的蛋白質（氨 基酸序列為SEQ ID No. 10)為將SEQ ID No. 2所示的蛋白質進行如下A41)和A42)的改造 得到的蛋白質：
[0100] A41)將 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突變為 Glu ;
[0101] A42)將 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突變為 Val。
[0102] 2、pBBRlMCS-2-Tsl、pBBRlMCS-2-Ts2、pBBRlMCS-2-Ts3 和 pBBRlMCS-2-Ts4 溫度敏 感性的驗證
[0103] 將步驟1的Tl (pBBRlMCS-2-Tsl)接種至LB+kan液體培養基中，于30°C培養18小 時，將得到的菌液進行以下處理：
[0104] ①將菌液按I :1000的比例接種至3mL LB液體培養基中，然后于30°C下培養18小 時，得到LB-30°C菌液；將LB-30°C菌液稀釋后得到LB-30°C稀釋菌液，將LB-30°C稀釋菌液 分別涂布至LB平板和LB+kan平板上，每個平板100 μ L LB-30°C稀釋菌液，然后于30°C下 培養18小時，分別得到LB-LB-30°C平板和LB-LB+kan-30°C平板，統計LB-LB-30°C平板和 LB-LB+kan-30°C平板上的菌落數，計算得到重組載體pBBRlMCS-2-Tsl在30°C LB液體培養 基中的丟失率（表2)，載體的丟失率=(LB-LB-30°C平板上的菌落數一 LB-LB+kan-30°C平 板上的菌落數）+LB-LB-30°C平板上的菌落數；
[0105] ②將菌液按I :1000的比例接種至3mL LB+kan液體培養基中，然后于30°C下培 養18小時，得到LB+kan-30 °C菌液；將LB+kan-30 °C菌液稀釋后得到LB+kan-30 °C稀釋 菌液，將LB+kan-30°C稀釋菌液分別涂布至LB平板和LB+kan平板上，每個平板100 μ L LB+kan-30 °C稀釋菌液，然后于30 °C下培養18小時，分別得到LB+kan-LB-30 °C平板和 LB+kan_LB+kan_30