溫度敏感型載體pBBR1MCS-2-Ts3及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物技術領域中溫度敏感型載體PBBR1MCS-2-TS3及其應用。
【背景技術】
[0002] 把一段有用的目的DNA片段通過DNA重組技術，送進受體細胞中去進行復制和表 達的工具叫載體（Vector)。質粒是重組DNA技術中常用的載體，質粒存在于許多細菌以及 酵母菌等生物中，是細胞染色體外能夠自主復制的很小的環狀DNA分子。一個理想的載體 大致應有下列一些特性：（1)分子量小、多拷貝、松弛控制型；（2)具有多種常用的限制性內 切酶的單切點；（3)能插入較大的外源DNA片段；(4)具有遺傳標記，便于鑒定和篩選；（5) 對宿主細胞無害。
[0003] 寬宿主質粒pBBRlMCS-2是應用性很廣的載體，該質粒由pBBRl質粒改造而來。 pBBRl 質粒來源于革蘭氏陰性菌 Bordetella bronchiseptica S87 (Antoine R and Locht C. Isolation and molecular characterization of a novel broad-host-range plasmid from Bordetella bronchiseptica with sequence similarities to plasmids from Gram-positive organisms. Mol Microbiol. 1992, 6 (13) : 1785-1799)。pBBRlMCS-2 含有一 個卡那霉素（kan)抗性篩選標記，它的大小僅有5145bp，這些特性使得該質粒適用于DNA克 隆、蛋白表達，廣泛用于革蘭氏陰性菌的分子操作。
[0004] 溫度敏感型質粒載體可以方便的控制質粒在宿主中的存在。當溫度比較低時，質 粒可以存在宿主中，而當溫度提高后，溫度敏感型質粒載體將丟失或整合到染色體上。
【發明內容】
[0005] 本發明所要解決的技術問題是如何構建溫度敏感型載體。
[0006] 為解決上述技術問題，本發明首先提供了構建重組載體的方法。
[0007] 本發明所提供的構建重組載體的方法，為構建重組載體的方法1，是將SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載體，將該重組載體命名為pBBRlMCS-2-Ts3 ;
[0008] 所述目的基因表達盒編碼的蛋白質為將SEQ ID No. 2所示的蛋白質進行A3)的改 造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質得到的蛋白質，即所述目的 基因表達盒編碼的蛋白質為SEQ ID No. 8所示的蛋白質；A3)為將SEQ ID No. 2第86位的 Arg突變為Cys。
[0009] 上述方法1中，所述目的基因表達盒中的目的基因為將SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進行B3)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1794-2456位 核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子；B3)為將SEQ ID No. 1第 2049位的C突變為T。
[0010] 其中，SEQ ID No. 1由5145個核苷酸組成，SEQ ID No. 1的第1794-2456位核苷酸 為rep的編碼基因，編碼SEQ ID No. 2所示的rep蛋白。
[0011] 上述方法1中，所述目的基因表達盒的序列可為SEQ ID No. 7。
[0012] 其中，SEQ ID No. 7的第238-900位編碼SEQ ID No. 8所示的蛋白質。
[0013] 上述方法1中，所述目的基因表達盒中啟動所述目的基因表達的啟動子為將SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進行如下C2)、C3)和C4)這三種中至少一種的 改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變 得到的DNA分子：
[0014] C2)如下 C21)和 / 或 C22):
[0015] C21)將 SEQ ID No. 1 第 1732 位的 A 突變為 G ;
[0016] C22)將 SEQ ID No. 1 第 1780 位的 G 突變為 T ;
[0017] C3)如下 C31)和 / 或 C32):
[0018] C31)將 SEQ ID No. 1 第 1747 位的 C 突變為 T ;
[0019] C32)將 SEQ ID No. 1 第 1776 位的 T 突變為 A ;
[0020] C4)將 SEQ ID No. 1 第 1751 位的 T 突變為 A ;
[0021] 所述目的基因表達盒中終止所述目的基因表達的終止子為SEQ ID No. 1的第 2457-2526位所示的DNA分子。
[0022] 為解決上述技術問題，本發明還提供了構建重組載體的方法。
[0023] 本發明所提供的構建重組載體的方法，為構建重組載體的方法2,是將SEQ ID No. 1的第1557-2526位所示的DNA片段替換為目的基因表達盒，并保持SEQ ID No. 1的其 他核苷酸不變，得到的重組DNA即為所述重組載體；
[0024] 所述基因表達盒中的基因編碼的蛋白質為將SEQ ID No. 2所不的蛋白質進行所述 A3)和下述A4)的改造、保持SEQ ID No. 2的其它氨基酸殘基均不變得到的蛋白質得到的蛋 白質：
[0025] A4)如下 A41)和 / 或 A42):
[0026] A41)將 SEQ ID No. 2 第 25 位的 Lys 突變為 Glu ;
[0027] A42)將 SEQ ID No. 2 第 146 位的 Ile 突變為 Val。
[0028] 上述方法2中，所述目的基因表達盒中的目的基因為將SEQ ID No. 1的第 1794-2456位核苷酸所示的DNA分子進行所述B3)和下述M)的改造、保持SEQ ID No. 1的 第1794-2456位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷酸均不變得到的DNA分子：
[0029] B4)如下 B41)和 / 或 B42):
[0030] B41)將 SEQ ID No. 1 第 1866 位的 A 突變為 G ;
[0031] B42)將 SEQ ID No. 1 第 2229 位的 A 突變為 G。
[0032] 上述方法2中，所述目的基因表達盒中啟動所述目的基因表達的啟動子為將SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進行所述C2)、所述C3)和所述C4)這三種中至 少一種的改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它核苷 酸均不變得到的DNA分子；
[0033] 所述基因表達盒中終止所述基因表達的終止子為SEQ ID No. 1的第2457-2526位 所示的DNA分子。
[0034] 為解決上述技術問題，本發明還提供了由所述方法1或所述方法2構建的重組載 體。
[0035] 為解決上述技術問題，本發明還提供了含有所述重組載體的重組微生物或重組細 胞系。
[0036] 所述重組微生物具體可為細菌、酵母、藻和真菌。其中，所述細菌可為大腸桿 菌或類球紅細菌。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌Escherichia coli T1、大腸桿菌 Escherichia coli DH5a、大腸桿菌 Escherichia coli BW25113 或大腸桿菌 Escherichia coli S17-1。所述類球紅細菌具體可為類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0037] 所述重組細胞系不包括繁殖材料。
[0038] 為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一產品：
[0039] Pl、所述蛋白質；
[0040] P2、所述目的基因；
[0041] P3、DNA分子，為將SEQ ID No. 1的第1557-1793位所示的DNA分子進行所述C3) 或下述Z34)的改造、保持SEQ ID No. 1的第1557-1793位核苷酸所示的DNA分子中的其它 核苷酸均不變得到的DNA分子；
[0042] Z34)為所述C3)和所述C4)。
[0043] 為解決上述技術問題，本發明還提供了下述任一應用：
[0044] L1、所述目的基因或所述DNA分子在制備溫度敏感載體中的應用；
[0045] L2、所述DNA分子在作為啟動子中的應用；
[0046] L3、所述重組載體在作為溫度敏感載體中的應用。
[0047] 上述L3所述應用可為所述重組載體在大腸桿菌或類球紅細菌中作為溫度敏 感載體中的應用。所述大腸桿菌具體可為大腸桿菌Escherichia coli T1、大腸桿菌 Escherichia coli DH5a、大腸桿菌 Escherichia coli BW25113 或大腸桿菌 Escherichia coli S17-1。所述類球紅細菌具體可為類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4.1。
[0048] 本申請中，所述溫度敏感載體為所述載體在一定溫度下可存在于宿主中，而改變 溫度后，所述載體不能存在于所述宿主中。具體可為所述載體在30°C下可存在于宿主中，當 溫度為37°C -42°C時，所述載體不能存在于所述宿主中。
[0049] 實驗證明，本發明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts3為溫度敏感載體：在宿主菌 分別為大腸桿菌Escherichia coli T1、大腸桿菌Escherichia coli DH5a、大腸桿 菌 Escherichia coli BW25113 和大腸桿菌 Escherichia coli S17-1 時，pBBRlMCS-2 和pBBRlMCS-2-Ts3在30°C LB液體培養基和30°C LB+kan液體培養基中的丟失率以及 pBBRlMCS-2在42°C LB液體培養基中的丟失率均在10%以下，而pBBRlMCS-2-Ts3在42°C LB 液體培養基中的丟失率均達到99. 99%;在宿主菌為類球紅細菌Rhodobacter sphaeroides 2. 4. 1 時，pBBRlMCS-2 和 pBBRlMCS-2-Ts3 在 30°C LB 液體培養基和 30°C LB+kan 液體培 養基中的丟失率以及PBBR1MCS-2在37°C LB液體培養基中的丟失率均在13 %以下，而 pBBRlMCS-2-Ts3在37°C LB液體培養基中的丟失率均達到80. 53%。
[0050] 實驗證明，本發明的重組載體PBBRlMCS-2-Ts3為溫度敏感載體可應用于：（1)載 體消除，即通過提高溫度移去載體；（2)單交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA整合 到染色體的同源區域；（3)雙交換同源重組，即通過提高溫度，讓載體DNA替換染色體上一 段 DNA。
【附圖說明】
[0051] 圖 1 為 pBBRlMCS-2 的圖譜。
【具體實施方式】
[0052] 下面結合【具體實施方式】對本發明進行進一步的詳細描述，給出的實施例僅為了闡 明本發明，而不是為了限制本發明的范圍。
[0053] 下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。
[0054] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0055] 下述實施例中的寬宿主載體pBBRlMCS-2為Biovector中國質粒載體菌株細胞株 基因保藏中心產品。
[0056] 下述實施例中的大腸桿菌Escherichia coli Tl為北京全式金生物技術有限公司 產品，目錄號為CD501-01。
[0057] 下述實施例中的大腸桿菌Escherichia coli