液:50 mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L 氯化鈉，250 mmol/L 咪唑，pH 8.00
[0022]N1-NTA親和層析后得到的ω -TA洗脫液經SDS-PAGE檢測為電泳純化，如圖3所示，該酶液用20 mM pH8.0磷酸緩沖液4°C透析24小時，除去咪唑等小分子雜質，該重組酶于4°C冰箱保存。
[0023]以外消旋的三氟丙酮為底物，利用純化的ω-ΤΑ酶為催化劑，于20?40°C、pH6.5?8.5的緩沖體系中進行轉化反應。例如，在2 mL的催化反應體系中，添加0.5 mgω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30 μ mo I L-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0~2 μ mo I PLP，在25°C反應0.5?3h，所得的產物用5mL乙酸乙酯萃取，萃取液用于氣相色譜分析底物的轉化率。萃取液加入I mL三乙胺后靜置5 11^11，然后再加入1.2 mL乙酰氯反應10 min，所得的反應液用手性毛細管氣相色譜法分析產物對映體過量值(ee )。
[0024]采用氣相色譜法分析底物的轉化率。所用氣相色譜儀為福立GC-9790氣相色譜儀，氣相色譜柱為30 mX250 ymX0.25 μπι KF-3，進樣口和檢測器溫度分別為180 °〇和200 0C，FID檢測器，載氣(氮氣)流速30 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為300mL/min。程序升溫條件為50 °C維持5 min, 10 °C/min升溫至180 °C，維持5min。
[0025]用手性毛細管氣相色譜法分析產物對映體過量值(ee)。所用氣相色譜儀為滕州經瑋GC8100，手性毛細管氣相色譜柱為0.25 mmX25 m FS-LIPODEX-E，進樣量為3 μ?，進樣口和檢測器溫度分別為180 °0和200°0，載氣(氮氣)流速30 mL/min，氫氣流速為30 mL/min，空氣流速為300 mL/min。程序升溫條件為100°C維持2 min, 5°C /min升溫至150°C，維持5min。
[0026]實施例1 在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.25 mg ω-ΤΑ,5 μπιο?三氟丙酮、15μ mo I L-天冬氨酸以及0.1 μ mo I PLP，在25 °C反應lh，得到轉化率為97.0%的三氟丙胺。
[0027]實施例2
在2 mL的20 mM pH 7.5磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μ mo I三氟丙酮、30μ mo I L-丙氨酸以及0.2 μ mo I PLP，在25 °C反應2h，得到轉化率為93.0%的三氟丙胺。
[0028]實施例3
在10 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加2 mg ω-ΤΑ,50 μπιο?三氟丙酮、150μ mo I L-天冬氨酸以及I μπιο? PLP，在25 °C反應3h，得到轉化率為92.0%的三氟丙胺。
[0029]實施例4
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-天冬氨酸以及0.2 μ mo I PLP，在25 °C反應lh，得到轉化率為96.0%的三氟丙胺。
[0030]實施例5
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-天冬氨酸以及0.2 μ mo I PLP，在25 °C反應3h，得到轉化率為99.2%的三氟丙胺。
[0031]實施例6
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-天冬氨酸以及O μπιο? PLP，在25 °C反應lh，得到轉化率為92.0%的三氟丙胺。
[0032]實施例7
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-天冬氨酸以及I μπιο? PLP，在25 °C反應lh，得到轉化率為92.0%的三氟丙胺。
[0033]實施例8
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-天冬氨酸以及0.2 μ mo I PLP，在20 °C反應3h，得到轉化率為95.0%的三氟丙胺。
[0034]實施例9
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-天冬氨酸以及0.2 μ mo I PLP，在30 °C反應2h，得到轉化率為94.6%的三氟丙胺。
[0035]實施例10
在2 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.5 mg ω-TAUO μπιο?三氟丙酮、30μ mo I L-丙氨酸以及0.2 μ mo I PLP，在40 °C反應2h，得到轉化率為95.2%的三氟丙胺。
[0036]實施例11
在10 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.25 mg ω-ΤΑ,50 μπιο?三氟丙酮、150μ mo I L-天冬氨酸以及5 μ mo I PLP，在25 °C反應lh，得到轉化率為91.0%的三氟丙胺。
[0037]實施例12
在10 mL的20 mM pH 8.0磷酸緩沖液中，添加0.25 mg ω-ΤΑ,50 μπιο?三氟丙酮、150μ mo I異丙胺以及5 μ mo I PLP，在25 °C反應lh，得到轉化率為90.0%的三氟丙胺。
【主權項】
1.一種ω-轉氨酶突變體基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。2.如權利要求1所述的一種ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。3.如權利要求2所述的一種ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶在催化合成三氟甲基胺類化合物中的應用。4.如權利要求2所述的一種ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶在催化合成三氟丙胺中的應用。5.如權利要求4所述的應用，其特征在具體包括以下步驟:以外消旋的三氟丙酮為氨基受體，在I?10 mL的pH為6.5?8.5磷酸鹽緩沖液中加入摩爾比為1:2?4的L-天冬氨酸、L-丙氨酸或異丙胺作為氨基供體，加入0.5 mg的ω -轉氨酶作為生物催化劑，反應0.5?3小時，反應溫度為20?40°C，得到轉化率超過80%以及ee>90%的三氟丙胺。
【專利摘要】一種ω-轉氨酶突變體基因及其應用，屬于分子生物學技術領域。該ω-轉氨酶突變體基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，該ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本發明首先是提供一種ω-轉氨酶的變體基因，其編碼對應的ω-轉氨酶具有較高的產酶量，因此，在工業生產中可以提高生物催化與轉化的效率。本發明還提供變體基因編碼表達的ω-轉氨酶在制備三氟丙胺的應用，在緩沖液中添加三氟丙酮作為底物進行反應，然后從反應液中收集產物三氟甲基胺類化合物。本發明方法制備三氟丙胺具有反應條件溫和、無污染且工藝簡單等顯著特點。
【IPC分類】C12N9/10, C12P13/00, C12N15/54
【公開號】CN104894148
【申請號】CN201510171434
【發明人】黃 俊, 蔣成君, 程桂林, 樓堅
【申請人】浙江科技學院
【公開日】2015年9月9日
【申請日】2015年4月13日