一種ω-轉氨酶突變體基因及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬于分子生物學技術領域，具體涉及一種ω-轉氨酶突變體基因及其應用。
【背景技術】
[0002]光學純手性胺是一類有重要價值的醫藥及精細化工中間體，對手性胺類化合物的不對稱合成進行深層次研宄具有較大的經濟效益和應用價值。目前，超過70%的藥物都是手性胺及其衍生物，如神經類藥物、心血管藥物、抗高血壓藥物、抗感染藥物及疫苗等的合成都是以手性胺作為中間體。
[0003]轉氨酶既可以通過動力學拆分消旋胺，也能通過酮的不對稱合成生成手性胺，比傳統化學催化方法更具有吸引力和競爭力，已成為工業上用于生產氨基酸、手性胺、氨基醇和氨基糖等重要農藥或醫藥中間體的常用酶之一。作為5-磷酸吡哆醛(PLP)依賴型的轉氨酶，在反應過程中存在PLP和5-磷酸吡哆胺(PMP)的互相轉換，催化的是典型的雙底物反應，遵循乒乓反應機制。根據PFAM數據庫中的多序列比對，轉氨酶可以被分為5類:天冬氨酸轉氨酶、芳香族轉氨酶、ω-轉氨酶、支鏈轉氨酶和D-轉氨酶。由于ω-轉氨酶的底物結合口袋大于天冬氨酸轉氨酶、芳香族轉氨酶，并可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工業應用價值。
[0004]手性胺在醫藥、農藥和化學產業中起到非常重要的作用，它們通常作為中間體或合成單體用于制備各種諸如藥物活性物質的生理活性物質，例如頭孢菌素或吡咯烷衍生物等為數眾多的手性胺的各種應用中，只有一種特定的光學活性形式，即(奶或對映體是有生理活性的。合成α-三氟甲基胺類化合物的化學方法主要有采用三氟甲基化試劑直接對胺類底物引入三氟甲基基團。然而，三氟甲基化試劑如C6H5SCF3等比較昂貴，且難以制備；而三氟甲基亞胺底物不穩定、易分解，在反應過程中容易水解，所以上述化學合成方法，不適合放大實驗和產業化。與傳統的化學合成方法相比，酶法通常使用更為溫和的條件，并且能夠獲得合理的立體選擇性。但是，通常使用的酶底物特異性、對映體選擇性和/或轉化率對于工業化的生產過程還不夠高。另外，使用轉氨酶生產光學活性胺的一個最主要的缺陷是常常會發生底物和產物抑制現象。
【發明內容】
[0005]針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種ω -轉氨酶突變體基因及其應用的技術方案。
[0006]所述的一種ω-轉氨酶突變體基因，其特征在于其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所不O
[0007]所述的一種ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶，其特征在于其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0008]所述的一種ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶在催化合成三氟甲基胺類化合物中的應用。
[0009]所述的一種ω-轉氨酶突變體基因編碼表達的ω-轉氨酶在催化合成三氟丙胺中的應用。
[0010]所述的應用，其特征在具體包括以下步驟:以外消旋的三氟丙酮為氨基受體，在I?10 mL的pH為6.5?8.5磷酸鹽緩沖液中加入摩爾比為1:2?4的L-天冬氨酸、L-丙氨酸或異丙胺作為氨基供體，加入0.5 mg的ω -轉氨酶作為生物催化劑，反應0.5?3小時，反應溫度為20?40°C，得到轉化率超過70%以及ee>90%的三氟丙胺。
[0011]本發明首先是提供一種ω-轉氨酶的變體基因，其編碼對應的ω-轉氨酶具有較高的產酶量，因此，在工業生產中可以提高生物催化與轉化的效率。
[0012]本發明還提供變體基因編碼表達的ω-轉氨酶在制備三氟丙胺的應用，在緩沖液中添加三氟丙酮作為底物進行反應，然后從反應液中收集產物三氟甲基胺類化合物。本發明方法制備三氟丙胺具有反應條件溫和、無污染且工藝簡單等顯著特點。
【附圖說明】
[0013]圖1為密碼子優化前后ω-轉氨酶基因序列的比對。
[0014]圖2為密碼子優化前后的mRNA 二級結構對比。a密碼子優化前；b密碼子優化后。
[0015]圖3為重組表達ω -轉氨酶純化結果的SDS-PAGE分析。1-細胞破碎液；2_上樣穿透液；3-20mM咪唑洗脫液；4-50mM咪唑洗脫液；5_100 mM咪唑洗脫液；6-250mM咪唑洗脫液。
[0016]
【具體實施方式】
[0017]以下結合實施例來進一步說明本發明。
[0018]為進一步說明本發明，結合以下實例具體說明。實施例所描述的具體物料配比、工藝條件及其結果僅用于說明本發明，而不應當也不會限制權利要求書中所詳細描述的本發明。本發明實施中未注明的實驗方法，如感受態細胞制備、轉化以及LB培養基配制等參照《分子克隆實驗指南》第三版(J.薩姆布魯克、D.W.拉塞爾著，黃培堂譯，科學出版社，2002)中的方法進行。
[0019]根據NCBI 數據庫中 Chromobacterium v1laceum DSM30191 的 ω-轉氨酶基因序列(Genbank: NP_901695)以及密碼子使用數據庫(http://www.kazusa.0r.jp/codon/)中飽Escherichia 密碼子使用頻率分布表，分析ω -轉氨酶的密碼子使用情況。將Ε.中密碼子使用頻率小于15%的定義為稀有密碼子，密碼子優化的過程中根據以下原則:不改變ω-轉氨酶所編碼的氨基酸序列；將ω-轉氨酶中的稀有密碼子替換為使用頻率較高的密碼子，并且按照密碼子使用頻率比例分配同一氨基酸不同的密碼子使用，去除ω-轉氨酶的基因密碼子優化過程產生的限制性內切酶酶切位點，參考pET_28a(+)載體所有的酶切位點。如圖2所示，密碼子優化后有17%的核苷酸發生了變化，對優化前后ω-轉氨酶的mRNA 二級結構進行預測，結果顯示優化后的mRNA 二級結構比優化之前簡單，發卡結構明顯減少，而且自由能增加說明穩定的二級結構量減少。密碼子優化的ω-轉氨酶基因(ω-opt-TA基因)，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。按照E.的密碼子偏好性及基因二級結構優化對野生型ω-轉氨酶進行改造，改造后的基因序列與野生型序列同源性為83% (圖1)，其編碼的蛋白質共459個氨基酸，氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。本發明中經密碼子優化ω-轉氨酶基因(ω-opt-TA基因)委托南京金斯瑞生物工程有限公司進行全基因合成，基因合成服務中使用pET_28a質粒作為克隆載體。構建的重組質粒pET-28a- ω -0pt_TA 轉入 E.coli BL21 (DE3 )，獲得重組菌。
[0020]上述重組菌的表達方法如下:將帶有重組質粒pET-28a_ω-opt-TA的重組工程菌接種到20 mL含有50 Pg/mL卡那霉素的LB液體培養基中，37°C、180 rpm振蕩過夜培養，然后以1%的接種量接種到含有50 Pg/mL卡那霉素的100 mL LB液體培養基，37°C、180 rpm培養至0D600為0.6?0.8時，加入IPTG (終濃度為I mmol/L)，25°C、150 rpm繼續誘導18 ho誘導結束后，4 °〇下4000Xg離心10 min，收集菌體沉淀。用pH 8.0、0.1 mol/L的磷酸緩沖液洗滌兩次，除盡培養基后再用原發酵液體積1/10的破胞緩沖液重懸細胞，在冰浴中超聲破胞90次(300 W，工作3 S，間隙6 s)，12000Xg離心10 min收集上清，即得到含有轉氨酶活性的粗酶液。
[0021]采用N1-NTA親和層析對所得的粗酶液進行分離純化。經上樣、清洗和洗脫，收集洗脫液，透析除去小分子即得到純酶。適當稀釋后，以考馬斯亮藍法測定純酶的濃度。N1-NTA親和層析過程中，細胞裂解緩沖液:50 mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300 mmol/L氯化鈉，20 mmol/L咪唑，pH 8.0 ;洗脫緩沖液:50 mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，100 mmol/L咪挫，pH 8.0 ;再生緩沖