胞因子GM-CSF以及IL-4。將細胞培養瓶放入CO2細胞培養箱中誘導培養。
[0039]3.CIK細胞種子細胞的凍存:
[0040]I)免疫細胞凍存液的配制:40ml預冷的1640培養基中加入14ml的胎牛血清和14ml的預冷的細胞凍存保護液(DMS0:右旋糖苷:ddH20按照質量比11:1:8配制)混合均勻。
[0041]2)將剩余的細胞再次離心并取出5*106個細胞進行流式細胞檢測(圖1)，離心參數:300g、19度、10分鐘。離心后以50ml刻度吸管盡量吸棄全部上清后以剛剛配制的免疫細胞凍存液重懸細胞至細胞濃度2.5*107/ml并輕柔的混合均勻。
[0042]3)將細胞懸液按照4ml/支分裝到4.5ml細胞凍存管中(每管共有1*108個細胞)，標記好細胞信息后將全部凍存管放入已經預冷至4°C的程序降溫凍存盒中并放入-80°C冰箱中。
[0043]4.DC細胞種子細胞的回收和凍存:
[0044]I) DC細胞誘導培養3天后取出細胞培養瓶在_20°C冰袋上放置lOmin，然后大力拍擊細胞培養瓶的細胞生長面至細胞幾乎全部懸浮。
[0045]2)將6瓶細胞懸液平均轉移至2個250ml離心管中，然后在每個細胞培養瓶中加入30ml預冷至4°C的生理鹽水沖洗培養瓶后也加入到2個離心管中(2個250ml離心管中每管約有240ml細胞懸液)離心并取出200ul細胞懸液進行細胞計數，離心參數:300g、19度、10分鐘。然后取出5*106個細胞進行流式細胞檢測(圖2).
[0046]3)免疫細胞凍存液的配制:16ml預冷的1640培養基中加入4ml的胎牛血清和4ml的預冷的細胞凍存保護液(DMSO和右旋糖酐按照質量比10:1配制)混合均勻。
[0047]4)離心后的細胞以50ml刻度吸管盡量吸棄全部上清后以剛剛配制的免疫細胞凍存液重懸細胞至細胞濃度2.5*107/ml并輕柔的混合均勻。將細胞懸液按照4ml/支分裝到
4.5ml細胞凍存管中，標記好細胞信息后將全部凍存管放入已經預冷至4°C的程序降溫凍存盒中并放入-80 0C冰箱中。
[0048]5) 24-48h后將全部凍存的CIK種子細胞和DC細胞全部轉移至液氮中保存
[0049]5.復蘇凍存的CIK種子細胞并按照生產流程誘導CIK細胞:
[0050]I)從液氮中取出I支凍存6個月的CIK種子細胞在37°C水浴中快速復蘇后加入到I個T-175細胞培養瓶中并在培養瓶中加入50ml CIK細胞誘導培養基(基礎培養基中加入血清、IL-2、IFN-r以及⑶3單抗)，取出200ul細胞懸液進行細胞計數(細胞總數為9.3*107)后將細胞放入0)2培養箱中培養。
[0051]2) 18-24h后將全部細胞懸液轉移至I個250ml離心管中離心，離心參數:300g、19度、10分鐘。
[0052]3)離心后的細胞以50ml刻度吸管盡量吸棄全部上清后加入50ml新鮮的CIK細胞誘導培養基(基礎培養基中加入血清、IL-2、IFN-r以及CD3單抗)，將細胞放入CO2培養箱中培養。
[0053]4)從接種后的第3天開始按照每2天倍增培養體系的擴增方法進行誘導培養至第13天(培養體系1600ml，在細胞培養袋中培養)將細胞混合均勻后細胞計數為2.0*106/ml，共獲得2.6*109個細胞
[0054]5)流式細胞檢測收獲的細胞中CD3+CD56+細胞群的比例(圖3)。
[0055]6)以誘導的CIK細胞對Hela細胞進行殺傷實驗，最終的殺傷率為58%.
[0056]6.復蘇DC細胞繼續進行誘導培養:
[0057]I)從液氮中取出I支凍存的DC種子細胞在37°C水浴中快速復蘇后接種至T-175細胞培養瓶中，并加入50ml DC細胞誘導培養基(基礎培養基中加入血清、IL-4和GM-CSF)。取出200ul細胞懸液進行細胞計數(細胞總數為8.9*107)后將細胞放入CO2培養箱中培養。
[0058]2) 18-24h后將全部細胞懸液轉移至I個250ml離心管中離心，離心參數:300g、19度、10分鐘。
[0059]3)離心后的細胞以50ml刻度吸管盡量吸棄全部上清后加入50ml新鮮的DC細胞誘導培養基(基礎培養基中加入血清、IL-4和GM-CSF)后將細胞放入0)2培養箱中培養。
[0060]4)細胞培養后第3天加入DC細胞成熟誘導因子TNF-a后再繼續培養2天后收獲所有細胞進行細胞計數共獲得7.8*107個細胞流式細胞檢測收獲細胞中成熟DC細胞表面標志物(圖4)。
[0061]綜上所述，本發明的內容并不局限在上述的實施例中，相同領域內的有識之士可以在本發明的技術指導思想之內可以輕易提出其他的實施例，但這種實施例都包括在本發明的范圍之內。
【主權項】
1.一種細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，包括以下步驟: A.凍存步驟 (1)離心分離外周血單個核細胞使其數量級達到19以上，并按照一定比例分裝到第一離心管和第二離心管； (2)配制單個核細胞凍存液并加入到第一離心管，程控降溫后放入-80°C冰箱； (3)將淋巴細胞培養基加入到第二離心管，混勻后將其轉移到T-175培養瓶中并繼續加入淋巴細胞培養基、DC細胞誘導細胞因子GM-CSF、IL-4，0)2細胞培養箱中誘導培養； (4)將步驟⑵獲得的DC細胞在-20°C冰袋放置9?Ilmin后拍打至細胞全部懸浮，并轉移到離心管離心； (5)配制DC細胞凍存液，并加入到第二離心管混勻、分裝，程控降溫后放入-80°C冰箱； (6)將凍存24?48h的單個核細胞、DC細胞轉移至_196°C液氮灌保存； B.復蘇步驟 (7)將液氮凍存的單個核細胞復蘇后轉移到T-175培養瓶，并按照一定比例添加CIK細胞誘導培養基，于CO2培養箱培養； (8)將液氮凍存的DC細胞復蘇后轉移到T-175培養瓶，并按照一定比例添加DC細胞誘導培養基，于CO2培養箱培養，并與復蘇后的DC細胞混合。
2.根據權利要求1所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，所述步驟(I)按照2:I的比例分裝第一離心管和第二離心管。
3.根據權利要求1所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，所述步驟(3)DC細胞誘導因子GM-CSF的添加量為終濃度1000u/ml、IL-4的添加量為終濃度1000u/ml，CO2培養箱中培養時間為3天。
4.根據權利要求1所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，所述步驟(2)單個核細胞凍存液組成為:體積比為60%預冷的1640培養基、20%的胎牛血清、20%細胞凍存保護劑。
5.根據權利要求1所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，所述步驟(5)DC細胞凍存液組成為:體積比為60%預冷的1640培養基、20%的胎牛血清和20%細胞凍存保護劑。
6.根據權利要求1所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，單核核細胞和DC細胞凍存保護劑組成為:DMS0:右旋糖苷:ddH20按照質量比11:1:8配制。
7.根據權利要求5或6所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，所述DC細胞凍存濃度為(I?2)xlOVmlo
8.根據權利要求4或6所述的細胞凍存與復蘇的方法，其特征在于，所述單個核細胞凍存濃度為(2?5) XlOVml。
9.一種如權利要求1?8任一項所述細胞凍存與復蘇的方法制備的細胞制劑。
10.根據權利要求9所述的細胞制劑，其特征在于，包括細胞數(I?9)X 10 7的成熟DC細胞與細胞數為(I?9) X 19的CIK細胞。
【專利摘要】本發明公開了一種細胞凍存與復蘇的方法及其制備的細胞制劑，將一份單個核細胞分別以單個核細胞與初步誘導的未成熟DC細胞方式于-196℃液氮凍存的方法，以及將凍存的單個核細胞復蘇并直接誘導為CIK、將凍存的未成熟的DC細胞復蘇并誘導為成熟DC細胞的方法，既能避免每次采集的單個核細胞浪費，保證細胞的活性、數量等指標，又能滿足DC-CIK細胞治療臨床應用與規模化儲存服務。
【IPC分類】C12N5-0783, C12N5-0784, A01N1-02, C12N5-078
【公開號】CN104862275
【申請號】CN201510223276
【發明人】陳曉波, 洪敬欣, 韓洪起, 武文杰, 靳霞, 王雪蓮, 張宇光, 韓俊領
【申請人】協和干細胞基因工程有限公司
【公開日】2015年8月26日
【申請日】2015年5月5日