一種細胞凍存與復蘇的方法及其制備的細胞制劑的制作方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種細胞凍存與復蘇的方法及其制備的細胞制劑。
【背景技術】
[0002]在分子生物學及生物工程技術飛速發展的推動下，以免疫細胞治療為基礎發展而來的生物治療日益受到重視，逐步成為現代惡性腫瘤治療中繼放、化療及手術后的第四大治療模式。目前臨床應用治療效果較好的是DC-CIK免疫細胞治療，也是國內細胞治療的主流。為解決免疫細胞治療中患者需要多次采血的問題，以及保障治療療程，臨床上大多采用凍存外周血單個核細胞后進行免疫細胞誘導的方法，或直接CIK凍存免疫細胞的方法，一定程度上滿足了臨床需求。但是，這些方法也都存在各自的缺陷:第一，目前大多將每次采集的單個核細胞以單一細胞種類凍存，不能實現一次采集單個核細胞滿足DC-CIK免疫細胞治療中對DC、CIK細胞數的要求；第二，由凍存的單個核細胞直接誘導DC細胞存在誘導效率低的問題，而直接凍存誘導成熟的DC細胞則會導致細胞裂解，破壞細胞均不能滿足臨床對DC細胞數的要求；第三，每次采集的單個核細胞在CIK在誘導過程中不斷增殖的特性，使其遠遠超出臨床對其19細胞數量級的要求，若為節省CIK細胞制備成本就會浪費部分單個核細胞，若直接將采集的單個核細胞都進行CIK細胞誘導并凍存，則會增加凍存成本，占據液氮罐的凍存空間，近而造成浪費，不利于規模化儲存服務。因此，需要一種新的凍存方法，既能避免每次采集的單個核細胞浪費，保證細胞的活性、數量等指標，又能滿足DC-CIK細胞治療臨床應用與規模化儲存服務。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是，提供一種將一份單個核細胞分別以單個核細胞與初步誘導的未成熟DC細胞方式于-196°C液氮凍存的方法，以及將凍存的單個核細胞復蘇并直接誘導為CIK、將凍存的未成熟的DC細胞復蘇并誘導為成熟DC細胞的方法及其制備的細胞制劑。
[0004]為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是:一種細胞凍存與復蘇的方法，包括以下步驟:
[0005]A.凍存步驟
[0006](I)離心分離外周血單個核細胞使其數量級達到19以上，并按照一定比例分裝到第一離心管和第二離心管；
[0007](2)配制單個核細胞凍存液并加入到第一離心管，程控降溫后放入_80°C冰箱；
[0008](3)將淋巴細胞培養基加入到第二離心管，混勻后將其轉移到T-175培養瓶中并繼續加入淋巴細胞培養基、DC細胞誘導細胞因子GM-CSF、IL-4，C02細胞培養箱中誘導培養;
[0009](4)將步驟⑵獲得的DC細胞在_20°C冰袋放置9?Ilmin后拍打至細胞全部懸浮，并轉移到離心管離心；
[0010](5)配制DC細胞凍存液，并加入到第二離心管混勻、分裝，程控降溫后放入-80°c冰箱；
[0011](6)將凍存24?48h的單個核細胞、DC細胞轉移至_196°C液氮灌保存；
[0012]B.復蘇步驟
[0013](7)將液氮凍存的單個核細胞復蘇后轉移到T-175培養瓶，并按照一定比例添加CIK細胞誘導培養基，于CO2培養箱培養；
[0014](8)將液氮凍存的DC細胞復蘇后轉移到T-175培養瓶，并按照一定比例添加DC細胞誘導培養基，于CO2培養箱培養，并與復蘇后的DC細胞混合。
[0015]所述步驟(I)按照2:1的比例分裝第一離心管和第二離心管。
[0016]所述步驟(3) DC細胞誘導因子GM-CSF的添加量為終濃度1000u/ml、IL-4的添加量為終濃度1000u/ml，CO2培養箱中培養時間為3天。
[0017]所述步驟⑵單個核細胞凍存液組成為:體積比為60%預冷的1640培養基、20%的胎牛血清、20%細胞凍存保護劑。
[0018]所述步驟(5)DC細胞凍存液組成為:體積比為60%預冷的1640培養基、20%的胎牛血清和20%細胞凍存保護劑。
[0019]單核核細胞和DC細胞凍存保護劑組成為:DMS0:右旋糖苷:ddH20按照質量比11:1:8 配制。
[0020]所述DC細胞凍存濃度為(I?2) xlOVml。
[0021]所述單個核細胞凍存濃度為(2?5)xlOVml。
[0022]上述細胞凍存與復蘇的方法制備的細胞制劑。
[0023]所述的細胞制劑，包括細胞數(I?9) X 17的成熟DC細胞與細胞數為(I?9) X 19的 CIK 細胞。
[0024]與現有技術相比，本發明的方法具有以下有益效果:第一，將單份外周血單個核細胞分別以單個核細胞、初步誘導DC細胞的方式分別凍存，解決了凍存后的單個核細胞向DC細胞誘導效率低的問題，提高了 DC細胞的純度，為臨床應用提供了更高質量的DC細胞；第二，避免了凍存CIK細胞造成的凍存成本高、凍存空間浪費的問題；第三，可以根據患者DC-CIK細胞治療的臨床需求，進行DC、CIK的混合培養，保障了 DC-CIK細胞治療中對DC、CIK細胞數量級的要求；第四，將單個核細胞初步誘導成未成熟細胞后進行凍存，避免了凍存成熟DC細胞造成細胞裂解；第五，凍存的單個核細胞、DC細胞的復蘇后，為除掉造成細胞毒性的DMS0，分別采用添加CIK誘導培養基、DC細胞誘導培養基的方法稀釋DMS0，使其終濃度控制在10%以內，而不采用直接清洗細胞的方法，避免細胞滲透壓高造成的細胞損傷；第六，本方法使用適合單個核細胞、DC細胞液氮凍存的復合的細胞凍存劑配置成最終的細胞凍存液，從而更好地保證凍存與復蘇的存活率；第七，本方法在細胞凍存過程中采取了程控降溫法凍存細胞，并且最終將細胞轉移到氣象液氮罐中進行長期保存，最大限度的提高了細胞的存活率和保存期限。
【附圖說明】
[0025]圖1是本發明分離獲得的的PBMC的流式檢測結果(CD3+CD4+: 52.13 % ；CD3+CD8+:30.69% ；CD3+CD56+:8.85% ;CD3+CD56-: 13.49% )。
[0026]圖2是培養3天后的DC種子細胞流式檢測結果(CDla+:8.68% ；CD83 +:0.57% ；CD86+:33.23% ;CD14 +:0.76% ;CD19 +:1.57% ;CDllb +:29.88% ) o
[0027]圖3是CIK細胞誘導16天流式檢測結果(CD3+CD56+;30.69% )。
[0028]圖4是誘導成熟DC細胞流式檢測圖(檢測成熟DC細胞表面標志物的表達情況:CDla 為 75% ；CD83 為 79% ；CD86 為 89% )。
【具體實施方式】
[0029]下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細說明:
[0030]本發明提供了一種高效的長期保存免疫細胞的種子細胞的方法。本發明書中FBS如無特別說明，均是指體積百分數。本說明書中使用的其他百分數，如無特別說明，則依從本領域慣常使用的含義。
[0031]實施例1
[0032]1.使用淋巴細胞分離液從外周血單采機采集的新鮮細胞中分離外周血單個核細胞(PBMC):
[0033]I)使用外周血單采機采集細胞6*109個細胞，以生理鹽水稀釋至300ml體積并加入肝素鈉注射液至終濃度為20u/ml。
[0034]2)在兩個250ml離心管中各加入75ml Ficoll淋巴細胞分離液，將300ml PBMC懸液平均分成兩份分別加入到離心管中的Ficoll上層(操作輕柔以保持明顯分層)。在離心機中離心，參數為:500g、19度、23分鐘、啟動和剎車I (本專利中所使用的離心機為THERMO公司生產的LEGEND RT+型臺式離心機，所有相關參數參閱離心機說明書)。
[0035]3)離心結束后輕輕取出離心管觀察液體出現明顯分層，以1ml刻度吸管將兩個離心管中淋巴細胞層(液體中的白膜層)分別取出至I個新的250ml離心管中并加入生理鹽水至終體積200ml。在兩個離心管中個取出200ul細胞懸液進行細胞計數，最終共獲得
2.3*109個細胞。
[0036]2.DC細胞的初步誘導分化:
[0037]I)將細胞再次離心，離心參數:300g、19度、10分鐘。離心結束后以50ml刻度吸管盡量吸棄全部上清后加入46ml淋巴細胞培養基重懸細胞并將2個離心管中的細胞混合至同一個中使得細胞的濃度為5*107/ml。
[0038]2)取出7.2*108個平均加入到6個T-175細胞培養瓶中并分別加入50ml淋巴細胞培養基并加入DC細胞誘導所需細