分比的任何范圍）的丁二酸收率（g)，或相對于碳源（例如葡萄糖）輸入量（g)至少56% (例如至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約85 %、至少 約90%、或至少約95%，或上述百分比的任何范圍）的丙酸收率（g)。在一些實施方案中， 所述收率可以被計算為丁二酸或丙酸產量（mol)/碳源（例如葡萄糖）輸入量（mol)的百 分比。因而，所述方法可以具有相對于碳源（例如葡萄糖）輸入量（mol)至少約154%的丁 二酸或丙酸收率（mol)。理想的是，所述方法可以具有相對于碳源（例如葡萄糖）輸入量 (mol)至少約130%或至少約170%的丁二酸或丙酸收率（mol)。
[0076] 所述方法可以產生相對高的丁二酸濃度（例如相對于在發酵中使用非重組微生 物的方法）。舉例來說，發酵可以達到至少約50g/L丁二酸（例如至少約60g/L、至少約70g/ L、或至少約80g/L)的濃度。理想的是，發酵可以達到至少約90g/L丁二酸（例如至少約100g/L丁二酸、至少約110g/L丁二酸、或至少約120g/L丁二酸）的濃度，或更理想的是， 至少約130g/L丁二酸的濃度，并且甚至更理想的是，至少約140g/L的濃度。在一些實施方 案中，發酵通常不產生顯著水平的不希望有的副產物，如乙酸鹽、甲酸鹽、丙酮酸鹽以及其 混合物（例如不多于約11. 〇g/L的乙酸鹽、不多于約10. 0g/L的乙酸鹽、不多于約9. 0g/L 的乙酸鹽、不多于約8.0g/L的乙酸鹽、不多于約7. 0g/L的乙酸鹽、不多于約6.0g/L的乙酸 鹽、不多于約5. 0g/L的乙酸鹽、不多于約4. 0g/L的乙酸鹽、不多于約3. 0g/L、或不多于約 2. 0g/L的乙酸鹽（例如1.5g/L或更少、或1.0g/L或更少）；不多于約2.0g/L的甲酸鹽（例 如1. 5g/L或更少、或1. 0g/L或更少）；和/或不多于約3. 0g/L的丙酮酸鹽（例如2. 5g/L 或更少、或2. 0g/L或更少、或1. 5g/L或更少、或1. 0g/L或更少））。
[0077] 本文所述的方法任選地產生相對高的生產速率。在各種實施方案中，所述方法實 現至少約1. 〇g/L-h、至少約1. 5g/L_h、至少約2. 0g/L-h、至少約2. 5g/L_h、至少約3. 0g/ L_h、至少約3. 5g/L_h、或至少約4. 0g/L-h的生產率。
[0078] 在一個實施方案中，重組微生物是表達異源zwf和mdh基因的琥珀酸放線桿菌。 可以對異源zwf和mdh基因進行優化以在琥泊酸放線桿菌中表達。異源zwf和mdh基因 可以由大腸桿菌編碼。舉例來說，重組生物體是以ATCC保藏號PTA-6255保藏的琥珀酸放 線桿菌（美國弗吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心（AmericanTypeCulture Collection,Manassas,VA,USA))，該瑭I自酸放線桿菌任選地經過修飾以過量產生Mdh。替代 性重組微生物是以ATCC保藏號PTA-120462保藏的琥珀酸放線桿菌菌株，該琥珀酸放線桿 菌菌株是與親本（未修飾）琥珀酸放線桿菌菌株相比產生增加水平的Zwf?和Mdh的菌株。 所述重組菌株能夠產生約50g/L至約150g/L濃度的丁二酸或丙酸（例如在利用合適的碳 源的發酵系統中）。重組菌株可以對至少約lg/L的一氟乙酸鈉的水平具有抗性。
[0079] 在另一個實施方案中，重組菌株是琥珀酸放線桿菌，所述琥珀酸放線桿菌包括含 有與異源zwf或mdh基因可操作地連接的琥泊酸放線桿菌的轉錄啟動子（例如與Zwf編碼 序列連接的琥珀酸放線桿菌啟動子和與Mdh編碼序列連接的琥珀酸放線桿菌啟動子）的 DNA分子（即多核苷酸）。所述轉錄啟動子可以包括琥珀酸放線桿菌磷酸烯醇丙酮酸（PckA) 羧激酶啟動子或其變體，它的序列公開在美國專利號8, 119, 377中。異源zwf基因可以編 碼大腸桿菌間酶或其變體。異源mdh基因可以編碼大腸桿菌Mdh酶或其變體。任選地，zwf 基因和/或mdh基因可以被優化以在琥珀酸放線桿菌中表達。DNA分子可以是表觀遺傳的 (例如存在于質粒上）。DNA分子可以包括選擇標記（例如卡那霉素抗性、氨芐西林抗性、鏈 霉素抗性、磺胺抗性、四環素抗性、氯霉素抗性或其組合）。
[0080] 在一些實施方案中，DNA分子（多核苷酸）包含產丁二酸微生物的轉錄啟動子，所 述轉錄啟動子與異源zwf基因可操作地連接。該轉錄啟動子可以包括zwf啟動子。DNA分 子可以存在于質粒內。DNA分子可以存在于宿主細胞（例如產生約50g/L至約150g/L的濃 度的丁二酸或丙酸的宿主細胞）中。
[0081] 在一個實施方案中，提供了用于生產丁二酸的方法。該方法包括使用表達異源zwf 基因以產生葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的重組微生物，任選地聯同表達異源mdh基因以產生蘋 果酸脫氫酶的第二重組微生物一起使營養培養基發酵。在各種實施方案中，重組微生物表 達異源mdh基因和異源zwf基因。重組微生物可以包括琥珀酸放線桿菌的重組菌株（例 如以ATCC保藏號PTA-6255保藏的琥珀酸放線桿菌重組菌株）。該重組微生物可以包括 Bisgaard分類群6、Bisgaard分類群10等的重組菌株。異源zwf基因可以包括大腸桿菌 zwf?基因。異源mdh基因可以包括大腸桿菌mdh基因。任選地，所述重組菌株對至少約lg/ L的一氟乙酸鈉水平具有抗性。任選地，所述重組菌株能夠產生約50g/L至約150g/L濃度 的丁二酸或丙酸。營養培養基可以包括發酵糖（例如葡萄糖）。通常，所述方法產生相對于 葡萄糖（g)至少約100 %的丁二酸收率（g)。
[0082] 在另一個實施方案中，重組微生物是產丁二酸微生物的重組菌株。所述重組微生 物包含（例如已被轉化而具有）異源zwf基因（即編碼葡萄糖-6-磷酸脫氫酶的異源多核 苷酸）。異源zwf基因可以被優化以在微生物中表達。在一些實施方案中，異源zwf基因可 以編碼大腸桿菌Zwf酶。
[0083] 在另一個實施方案中，重組微生物是產丁二酸微生物的重組菌株，所述重組菌株 已被轉化而具有包括與編碼具有Zwf?酶活性的多肽的多核苷酸可操作地連接的磷酸烯醇 丙酮酸（PckA)羧激酶的轉錄啟動子的DNA分子（多核苷酸）。重組微生物任選地已被轉 化而具有包括與編碼具有Mdh酶活性的多肽的多核苷酸可操作地連接的磷酸烯醇丙酮酸 (PckA)羧激酶的轉錄啟動子的DNA分子（多核苷酸）。轉錄啟動子可以包括琥珀酸放線桿 菌磷酸烯醇丙酮酸（PckA)羧激酶啟動子。在另一個實施方案中，重組微生物是被轉化而具 有表觀遺傳的DNA分子的重組菌株。所述DNA分子可以存在于質粒上。
[0084] 在另一個實施方案中，重組微生物是能夠產生約50g/L至約150g/L濃度的丁二酸 或丙酸的重組菌株。
[0085] 所述重組菌株可以對至少約lg/L的一氟乙酸鈉水平具有抗性。在一些實施方案 中，使用以ATCC保藏號PTA-6255保藏的重組琥珀酸放線桿菌產生重組菌株，或重組菌株是 以ATCC保藏號PTA-120462保藏的琥珀酸放線桿菌。
[0086] 在另一個實施方案中，在包括使用重組微生物使營養培養基發酵的方法中使用重 組微生物產生丁二酸或丙酸。營養培養基通常包括發酵糖，如葡萄糖或山梨糖醇。所述方法 可以產生相對于葡萄糖（g)至少約70%、至少約80%、至少約90%、或至少約100%的丁二 酸收率（g)。所述方法可以產生相對于葡萄糖（g)至少約62 %至約72%、或至少約60%、或 至少約70 %、或至少約80 %、或至少約90 % (或這些百分比以內的任何范圍）的丙酸（g)。
[0087] 用于生產有機酸的方法可以包括在含有碳源（例如粗山梨糖醇）的合適的發酵 液中培養合適的微生物。在一個實施方案中，發酵液還含有氮源、無機鹽、維生素或生長促 進因子等。在一些實施方案中，鹽、銨源以及其它營養培養基要求可以從玉米漿（CSL)中 獲得，所述玉米漿是玉米濕磨工業的副產物。對于鹽，鈉源包括但不限于Na3P04、Na2HP04、 NaH2P04、Na2C03、NaHC03、NaCl、以及來自有機鹽（例如谷氨酸一鈉、乙酸鈉）的Na。鈉濃度 可以在約1200mg/L至約6800mg/L的范圍內。在一些實施方案中，鈉濃度是約3000mg/l至 約3500mg/L。本發明不限于鈉鹽；其它鹽也被涵蓋作為本發明的一部分。
[0088] 通過將碳源和發酵液在任何合適的發酵罐中組合，并且使用合適的微生物進行接 種來進行發酵。可以在有助于微生物生長以及產生合適的有機酸的條件下進行好氧發酵或 厭氧發酵。在一個實施方案中，將發酵溫度維持在至少約25°C并且低于約50°C的范圍內。 在一些實施方案中，溫度是約30°C至約39°C(例如約38°C)。在一些實施方案中，溫度是 約30°C至約37°C。
[0089] 發酵液還可以包括甜菜堿或加成鹽或其混合物。在一些實施方案中，所述甜菜堿 是甜菜堿-HC1、甜菜堿游離堿等。
[0090] 在其它實施方案中，所述甜菜堿可以作為含有甜菜堿的飼料產品的組分存在。示 例性甜菜堿或含有甜菜堿的至少一種飼料產品包括甜菜堿、氨基酸發酵副產物可溶物、含 有甜菜堿的糖蜜、濃縮的分離器副產物、濃縮糖蜜可溶物、酒糟、或其任何混合物。含有甜菜 堿的飼料產品的其它實例包括濃縮的提取的谷氨酸發酵產品、來自賴氨酸發酵生產的氨基 酸發酵副產物可溶物、來自蘇氨酸發酵生產的氨基酸發酵副產物可溶物、或來自色氨酸發 酵生產的氨基酸發酵副產物可溶物。甜菜堿濃度可以在約0. 05g/l至約2g/l的范圍內。在 一些實施方案中，所用的甜菜堿濃度可以是0. 2g/l至0. 5g/l。
[0091] 在一個實施方案中，在發酵開始時發酵液的pH值在約pH6-7的范圍內或在約pH 7至約pH8.0的范圍內（例如約pH8.0)。發酵pH值可以通過添加堿來控制，例如可以控 制pH值以在發酵進行時實現約pH5至約pH7、或約pH6至約pH7 (例如約pH6. 6)、或 約pH4. 5至約6、或約5至約5. 5。鎂堿在本發明的背景下適合于控制pH值。在一個實施 方案中，提供MgC03以在CO2氣氛中控制pH值從而任選地實現約pH6. 0至約pH7. 0 (例如 約pH6. 4至約pH6. 8)，優選地約pH6. 6的近似pH值。Mg(OH)2也是適當的。可以使用 NH4OH、NaOH、氣態NH3、Na3P04或它們的碳酸鹽形式，盡管所述方法并不取決于具體的pH值 控制劑。
[0092] 實施例
[0093] 實施例1
[0094] 微生物菌株和質粒
[0095] 琥珀酸放線桿菌菌株FZ45和FZ53是對一氟乙酸鈉具有抗性的琥珀酸放線桿菌 130Z的穩定性細菌變體。參見Guettler等人，INT'LJ.SYST.BACT. (1999)49:207-216; 以及美國專利號5, 573, 931。大腸桿菌-琥珀酸放線桿菌穿梭載體pLS88(以ATCC保藏 號86980保藏在美國典型培養物保藏中心）是從加拿大曼尼托巴大學（Universityof Manitoba,Canada)的LeslieSlaney博士獲得的。質粒pLS88被描述為已從杜克雷嗜血桿 菌（Haemophilusducreyi)中分離并且可以賦予對磺胺