用于生產有機酸的重組微生物的制作方法
【專利說明】
[0001] 關于美國政府支持的聲明
[0002] 本發明的方面是在美國政府的支持下根據撥款號DE-FC36-02G012001作出的。
[0003] 相關申請的交叉引用以及以電子方式遞交的材料的以引用方式的并入
[0004] 本申請要求2012年10月2日提交的美國臨時專利申請號61/708, 998的優先權， 該美國臨時專利申請的公開內容特此以引用的方式整體并入本文。
[0005] 本申請含有作為本公開的單獨部分的呈計算機可讀形式的序列表（文件名： 40000A_SeqListing.txt，在2013年10月2日生成，20,065個字節），該序列表以引用的方 式整體并入本文。
技術領域
[0006] 本發明涉及被工程化以產生增加量的有機酸的微生物以及使用方法。
【背景技術】
[0007] 有機酸具有在諸如聚合物、食品、藥物以及化妝品等多種工業應用中取代以石油 化學方式衍生的單體的潛能。使用基于生物的有機酸可以減小對化石燃料的依賴并且在減 少二氧化碳產生方面有益于環境。
【發明內容】
[0008] 本發明公開了用于生產有機酸的重組微生物。所公開的重組微生物表達酶葡萄 糖-6-磷酸-1-脫氫酶以及蘋果酸脫氫酶，從而使得有機酸的產量增加。
[0009] 以下編號的段落各自簡明地限定了本發明的一個或多個示例性變化方案：
[0010] 1. 一種重組微生物，所述重組微生物表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果酸脫氫 酶。
[0011] 2.段落1的重組微生物，其中所述重組生物體是產丁二酸微生物。
[0012] 3.段落1的重組微生物，所述重組微生物包含與琥珀酸放線桿菌 (Actinobacillus succinogenes)的16S核糖體RNA序列具有至少90%同一性的16S核糖 體RNA序列。
[0013] 4.段落1的重組微生物，所述重組微生物是琥珀酸放線桿菌、Bisgaard分類群 (Bisgaard Taxon)6 以及 Bisgaard 分類群 10。
[0014] 5.段落1至4中任一段落的重組微生物，所述重組微生物包含編碼葡萄糖-6-磷 酸脫氫酶的異源多核苷酸或過表達的多核苷酸以及編碼蘋果酸脫氫酶的異源多核苷酸或 過表達的多核苷酸。
[0015] 6.段落1至5中任一段落的重組微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或蘋果 酸脫氫酶是琥珀酸放線桿菌酶。
[0016] 7.段落1至5中任一段落的重組微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果 酸脫氫酶是琥珀酸放線桿菌酶。
[0017] 8.段落1至6中任一段落的重組微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶或蘋果 酸脫氫酶是大腸桿菌（E.coli)酶。
[0018] 9.段落1至5中任一段落的重組微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果 酸脫氫酶是大腸桿菌酶。
[0019] 10.段落1至5中任一段落的重組微生物，其中所述葡萄糖-6-磷酸脫氫酶包含與 SEQIDN0:2中所示出的氨基酸序列具有至少約40%序列同一性的氨基酸序列。
[0020] 11.段落1至5中任一段落的重組微生物，其中所述蘋果酸脫氫酶包含與SEQID N0:4中所示出的氨基酸序列具有至少約60%序列同一性的氨基酸序列。
[0021] 12.段落1至11中任一段落的重組微生物，其中所述微生物與單獨表達葡萄 糖-6-磷酸脫氫酶或蘋果酸脫氫酶的微生物相比產生增加量的有機酸（例如丁二酸）。
[0022] 13.段落1至12中任一段落的重組微生物，其中所述微生物能夠產生約50g/L至 150g/L濃度的丁二酸。
[0023] 14. 一種用于生產有機酸的方法，所述方法包括在發酵培養基中培養段落1至13 中任一段落的重組微生物。
[0024] 15. -種生產有機酸的方法，所述方法包括在有利于產生有機酸的條件下使用碳 源培養重組微生物的步驟，其中所述重組微生物表達至少一種葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和蘋 果酸脫氫酶。
[0025] 16.段落15的方法，其中所述重組微生物表達葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果酸脫 氫酶這兩者。
[0026] 17. -種生產有機酸的方法，所述方法包括在有利于產生有機酸的條件下使用碳 源培養段落1至13中任一段落的重組微生物。
[0027] 18.段落15至17中任一段落的方法，其中所述有機酸是丁二酸或丙酸。
[0028] 19.段落18的方法，其中所述有機酸是丁二酸。
[0029] 20.段落15至19中任一段落的方法，其中所述碳源是葡萄糖或山梨糖醇。
【附圖說明】
[0030] 圖1描繪了 pL88載體的示意圖。
[0031] 圖2描繪了 pISTONSl的示意圖。
[0032] 圖3描繪了 p830. 60的示意圖。
[0033] 圖4描繪了 p856. 78的示意圖。
[0034] 圖5是來自大腸桿菌的Zwf酶的氨基酸序列（"查詢"）與來自琥珀酸放線桿菌的 Zwf?酶的氨基酸序列（"sbjct"）之間的序列比較。
[0035] 圖6是來自大腸桿菌的Mdh酶的氨基酸序列（"查詢"）與來自琥珀酸放線桿菌的 Mdh酶的氨基酸序列（"sbjct"）之間的序列比較。
[0036] 圖7是來自黃曲霉（Aspergillusflavus)的Mdh酶的氨基酸序列（"查詢"）與 來自琥珀酸放線桿菌的Mdh酶的氨基酸序列（"sbjct"）之間的序列比較。
[0037] 圖8是p830. 60中的琥珀酸放線桿菌zwf核酸序列。
[0038] 圖9是pISTONSl中的琥珀酸放線桿菌mdh核酸序列。
【具體實施方式】
[0039] 在以下【具體實施方式】中，實施方案被足夠詳細地描述以使得本領域技術人員能夠 實施這些實施方案，并且應當理解的是，也可以利用其它實施方案并且可以進行化學上的 和程序上的變化而不背離本發明主題的精神和范圍。以下【具體實施方式】因此不應被視作具 有限制性的意義，并且實施方案的范圍僅由所附權利要求書限定。
[0040] 術語"微生物"指的是單細胞生物體，如細菌、真菌或酵母。
[0041] 術語"重組微生物"指的是如下的微生物，所述微生物經過改變、修飾或工程化 (例如遺傳工程化）以使它與產生它的天然存在的微生物或起始微生物相比表現出改變、 改造或不同的基因型或表型（例如在遺傳修飾影響微生物的編碼核酸序列時）。
[0042] 遺傳操作可以包括但不限于改變或修飾與特定基因的表達有關的調節序列或位 點（例如通過使用強啟動子、誘導型啟動子或多重啟動子）；修飾特定基因的染色體位置； 改變靠近特定基因的核酸序列，如啟動子區域中包括對于啟動子活性來說重要的調節序列 的序列、核糖體結合位點、或轉錄終止子；增加特定基因的拷貝數；修飾涉及特定基因產物 的轉錄或翻譯的蛋白質（例如調節蛋白、抑制因子、增強因子、轉錄激活因子等）；或任何其 它提高特定基因的表達的常規手段。
[0043] 如本文所用的"有機酸"包括包含至少一個羧基的酸。任選地，所述有機酸是(^-(：1(| 有機酸，還任選地，所述有機酸包含兩個羧基。舉例來說，"有機酸"包括丁二酸或丙酸。有 機酸的其它實例包括但不限于乳酸、蘋果酸、檸檬酸、草酸以及酒石酸。如本文所用的有機 酸還可以包括有機酸陰離子或其鹽。舉例來說，"丁二酸"可以被稱為"丁二酸鹽"；"丙酸" 可以被稱為"丙酸鹽"。
[0044] "異源"指的是并非源于需要表達的特定細胞或生物體或并非是需要表達的特定 細胞或生物體原生的任何多核苷酸或多肽。
[0045] "過表達"指的是多核苷酸表達而產生比該多核苷酸通常在宿主細胞中表達的水 平更高的水平的產物（例如多肽或RNA)。過表達的多核苷酸一般是宿主細胞原生的多核苷 酸，所述多核苷酸的產物以比通常存在于宿主細胞中的量大的量產生。過表達是通過例如 而不限于使多核苷酸與和所述多核苷酸的原生啟動子不同的啟動子可操作地連接或將該 多核苷酸的另外的拷貝引入到宿主細胞中來實現。
[0046] "源自于"生物體的多肽或多核苷酸包含與來自該生物體的參考多肽或多核苷酸 相同的氨基酸序列或核酸序列，或任選地相對于原生氨基酸序列或核苷酸序列含有一處或 多處修飾，如下文進一步所述，并且任選地與原生酶相比即使沒有表現出更好的活性，也表 現出相似的活性（例如原生酶的活性水平的至少70 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %、至 少100%、或至少110% )。將了解的是，"源自于"生物體的多肽或多核苷酸不限于以物理 方式從特定的宿主生物體中取出的多肽或多核苷酸。
[0047] 此外在本文中，由端點表述數值范圍時，包括該范圍內所包括的所有數字（例如1 至5包括1、1. 5、2、2. 75、3、3. 80、4、5等）。此外，公開范圍時，包括公開了更寬范圍內所包 括的所有子范圍（例如1至5公開了 1至4、1. 5至4. 5、4至5等）。
[0048] 本發明提供了用于經由發酵生產有機酸的經過改進的材料和方法。發酵性能通常 通過以下三個參數來獲得：滴度、生產率以及收率。滴度表示在發酵結束時發酵液中產物 (例如有機酸，如丁二酸）的濃度。生產率或生產速率表示達到產物滴度的時間。收率是產 物的質量/原料（例如糖，如葡萄糖）的質量的商數。所有這三個參數均影響發酵生產工 藝的經濟情況。高滴度有助于產物回收；必須蒸發或去除更少的水，從而需要更少的能量， 這會降低工藝的操作成本。生產率與滴度相關聯，為滴度增添了時間維度。高生產率意味 著快速的發酵工藝，并且允許縮減發酵容器的尺寸，這是因為可以更頻繁地運行該工藝。生 產率主要影響發酵生產工藝的資金成本。收率影響該工藝的操作成本，即收率越高，則獲得 產物所需的原材料或原料越少。
[0049] 滴度、生產率以及收率相互交織并且相互影響。在短時間內實現高滴度的發酵將 產生高生產率，反之亦然。發酵產物的積聚或更高的滴度可以使生產減慢。收率與生產率呈 負相關，這是因為在發酵中不僅使用原料來支持生物體生長、細胞繁殖以及構筑生物質，而 且還使原料代謝成所需的產物。一般來說，更多的細胞將產生更多的產物并且將更快地產 生產物，從而將使得生產率更高，但會使得收率更低。因此，發酵優化必須使所有這三個參 數平衡以實現最為經濟的工藝。最終的目標在于實現所有這三個參數的值均較高的工藝。
[0050] 值得注意的是，發現在如本文所述的重組微生物（例如琥珀酸放線桿菌）中磷酸 戊糖途徑（或ED途徑（Entner-Doudoroffpathway))和三羧酸循環中的酶同時過量產生 以促進更高收率的丁二酸，所述收率是確定發酵工藝的經濟可行性的關鍵因素。在這方面， 本發明至少部分地以如下驚人的發現為基礎：在微生物中葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和蘋果酸 脫氫酶的產生使得有機酸的產量與由單獨表達單一酶的微生物所實現的產量水平相比有 所提高。磷酸戊糖循環（或ED途徑）利用多種酶，包括葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（例如葡萄 糖-6-磷酸-1-脫氫酶，它也被稱為間酶（