蛋白具有相似功能的功能性同系物、功能等價變體、衍生物和生物活性片段。POI可 以是與天然蛋白結構相似，可來源于天然蛋白，通過添加一個或多個氨基酸到C末端和N末 端中的任一個或兩個或天然蛋白的側鏈、在天然氨基酸序列的一個或多個不同位點取代一 個或多個氨基酸、在天然蛋白的一端或兩端或者在氨基酸序列的一個或幾個位點刪除一個 或多個氨基酸，或者在天然氨基酸序列的一個或多個位點插入一個或多個氨基酸。這些修 飾對于上述幾種蛋白是已知的。
[0221] POI還可選自底物、酶、抑制劑或輔因子，其在宿主細胞內提供生化反應，目的在于 獲得所述生化反應或幾種反應的級聯反應的產物，例如，以獲得宿主細胞的代謝物。示例性 的產品可以是維生素，例如維生素B2、有機酸和醇，其產量可在本發明重組蛋白或POI表達 后得到提高。
[0222] 具體而言，表達本發明重組產物的宿主細胞可以是適合POI重組表達的任意酵母 細胞。
[0223] 優選的宿主細胞選自畢赤酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬、Arxula酵母、漢遜氏 酵母、Ogatea酵母、耶氏酵母屬、克魯維酵母屬、酵母屬（Saccharomyces)或Komagataella 酵母，優選的是一甲醇營養型酵母，并且特別優選的是巴斯德畢赤酵母、Komagataella pastoris、K. phaffii 或 K. pseudopastoris。
[0224] 本發明優選的宿主細胞的實例包括但不限于畢赤酵母屬，例如巴斯德畢赤酵母或 甲醇畢赤酵母或 Komagataella 屬，例如 K. pastoris、K. pseudopastoris 或 K. phaffii 〇
[0225] 較新的文獻劃分了巴斯德畢赤酵母并將其重命名為Komagataella pastoris、 Komagataellaphaffii 和 Komagataella pseudopastoris。此處巴斯德畢赤酵母作為所 有種類的同義詞，包括 Komagataella pastoris、Komagataella phaffii 和 Komagataella pseudopastoris〇
[0226] 巴斯德畢赤酵母株的實例包括CBS 704( = NRRL Y-1603 = DSMZ 70382)、CBS 2612( = NRRL Y-7556)、CBS 7435( = NRRL Y-11430)、CBS 9173-9189(CBS 株：CBS-KNAW 真 菌生物多樣性中心，Centraalbureau voor Schimmelcultures,荷蘭烏特勒支），以及DSMZ 70877 (German Collection of Micro-organisms and Cell Cultures (德國微生物和細 胞培養物保藏中心）），還包括獲自Invitrogen公司的細胞株，例如，X-33、GS115、KM71和 SMD1168。所有上述細胞株已成功用于生產轉化株和表達異源基因。
[0227] 根據本發明，優選提供一酵母宿主細胞，其用一包含一啟動子序列的載體進行轉 化，該啟動子序列可操作地連接到本發明的信號序列或截短前導序列。
[0228] 根據本發明的優選模式，本發明的表達組件包括一啟動子，例如P. pastoris PGAP(磷酸甘油醛脫氫酶）啟動子、pAOX(醇氧化酶）啟動子或SEQ ID 9(圖1，pGl啟動 子），或者其功能變體。可只用這些啟動子序列的一部分獲得有效的序列活性。具體而言， 優選的部分啟動子序列由至少150個連續堿基或bp組成，更優選地，由至少200bp、至少 300bp、至少400bp、至少500bp、至少600bp、至少700bp、至少800bp或者至少900bp組成。 優選地，啟動子區域的3'末端包含在優選的部分啟動子序列內。
[0229] 在一優選的表達系統中，該啟動子是一可誘導的或一組成型啟動子。該啟動子可 以是宿主細胞的內源性啟動子或與宿主細胞異源的。可誘導的啟動子的一優選實例是PGl 啟動子，其在葡萄糖限制條件下可被誘導，并具有SEQ ID 9的核苷酸序列。
[0230] 本發明的一特定宿主細胞包含異源的或重組的啟動子序列，其可獲自不同于生產 宿主的細胞株，例如來自另一種酵母株，例如釀酒酵母株。在另一種特定的實施方式中，本 發明的宿主細胞包含一本發明的重組表達構建體，其包含來自與宿主細胞相同的屬、種或 株的細胞的啟動子。
[0231] 啟動子可以是任何DNA序列，其在宿主細胞中顯示出轉錄活性，并可獲自編碼與 宿主同源或異源的蛋白的基因。啟動子優選獲自編碼與宿主細胞同源的蛋白的基因。
[0232] 例如，本發明的一啟動子可獲自酵母，例如釀酒酵母株。但一尤其優選的實施方式 采用了一來源于巴斯德畢赤酵母的啟動子，用于在巴斯德畢赤酵母生產者宿主細胞系中生 產重組POI的方法中。核苷酸序列的同源性原點便于其結合到相同屬或種的宿主細胞中， 從而能夠穩定生產P0I，可能在工業制造過程中提高產量。此外，可使用來自其他合適酵母 或其他真菌或其他生物體如脊椎動物或植物的啟動子的功能活性變體。
[0233] 進一步合適的用于酵母宿主細胞的啟動子序列可包括但不限于獲自編碼代謝酶 的基因的啟動子，已知該代謝酶在細胞中以高濃度存在，例如糖酵解酶如磷酸丙糖異構酶 (TPI)、磷酸甘油酸激酶（PGK)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)、醇氧化酶（AOX)、乳糖酶 (LAC)和半乳糖苷酶（GAL)。
[0234] 合適的啟動子的優選實例是酵母啟動子，其包含一 DNA序列作為一啟動子用于酵 母細胞中的基因轉錄。優選的實例是釀酒酵母Mal、TPI、CUP、ADH或PGK啟動子，或者巴 斯德畢赤酵母的葡萄糖-6-磷酸異構酶啟動子（PPGI)、3_磷酸甘油酸激酶啟動子（PPGK) 或甘油醛磷酸脫氫酶啟動子PGAP、醇氧化酶啟動子（PAOX)、甲醛脫氫酶啟動子（PFLD)、 異檸檬酸裂合酶啟動子（PICL)、翻譯延長因子啟動子（PTEF)，以及巴斯德畢赤酵母的烯 醇酶1(PEN01)、磷酸甘油醛異構酶（PTPI)、a-酮異己酸脫羧酶（PTHI)、核糖體亞基蛋 白（PRPS2、PRPS7、PRPS31、PRPL1)、熱休克蛋白家族成員（PSSA1、PHSP90、PKAR2)、6_ 磷酸 葡萄糖酸脫氫酶（PGNDl)、磷酸甘油酸變位酶（PGPMl)、轉酮酶（PTKLl)、磷脂酰肌醇合成 酶（PPISl)、鐵-02-氧化還原酶（PFET3)、高親和力鐵通透酶（PFTRl)、可阻抑堿性磷酸酶 (PPH08)、N-肉豆蔻酰轉移酶（PNMTl)、外激素應答轉錄因子（PMCMl)、泛素（PUBI4)、單鏈 DNA內切核酸酶（PRAD2)的啟動子和線粒體內膜主要ADP/ATP載體的啟動子（PPET9)。
[0235] 如果POI是一與宿主細胞同源的蛋白，即在宿主細胞內天然產生的蛋白，那么該 POI在細胞內的表達可通過用一啟動子序列與其天然啟動子序列交換來進行調節，該啟動 子序列與宿主細胞異源或與宿主細胞同源但是與所述POI的天然啟動子序列不同。
[0236] 引入新啟動子的目的可例如通過用一重組DNA分子轉化一宿主細胞實現，該DNA 分子包含目標基因的同源序列以允許位點特異性重組，啟動子序列以及適合宿主細胞的選 擇性標記。可產生位點特異性重組以將編碼POI的核苷酸序列可操作地連接到啟動子序 列。這導致了從異源啟動子序列而非從天然啟動子序列表達P0I。
[0237] 在本發明的一尤其優選的實施方式中，本發明的啟動子序列相對于POI的天然啟 動子序列具有提尚的啟動子活性。
[0238] 根據本發明，還可以提供本發明的一通配型載體或表達組件，其包括本發明的一 信號序列或截短前導序列。這種通配型載體或表達組件即時可結合編碼POI的目標基因。 因此，該通配型細胞系是一預先形成的宿主細胞系，特征是其表達能力。這遵循了一創新的 "通用型"平臺策略，用于產生生產者細胞系，用于生產P0I，例如，使用位點特異性組件整合 或位點特異性的重組酶介導的組件交換。這種新的宿主細胞便于克隆目標基因（GOI)到例 如預定基因組表達位點，以獲得可復制的高效生產細胞系。
[0239] 根據優選實施方式，本發明的表達載體是一質粒，其適合以每個細胞單拷貝或多 拷貝的形式整合到宿主細胞的基因組中。編碼POI的重組核苷酸序列也可以每個細胞單拷 貝或多拷貝形式提供于自主復制的質粒上。優選的質粒是真核細胞表達載體，優選是酵母 表達載體。
[0240] 表達載體可包括但不限于克隆載體、修飾的克隆載體和特殊設計的質粒。用于本 發明的優選的表達載體可以是任何適合在宿主細胞中表達重組基因的表達載體，并根據宿 主生物體進行選擇。重組表達載體可以是任何能夠復制到或整合到宿主生物體的基因組中 的載體，也可稱為宿主載體，例如酵母載體，其攜帶本發明的DNA構造體。一優選的酵母表 達載體適合在甲醇營養型酵母中表達，該甲醇營養型酵母以漢遜氏酵母屬、Ogatea酵母屬、 畢赤酵母屬、假絲酵母屬和球擬酵母屬為代表。
[0241] 在本發明中，優選使用獲自 pPICZ、pGAPZ、pPIC9、pPICZalfa、pGAPZalfa、pPIC9K、 pGAPHis或pPUZZLE的質粒作為載體。
[0242] 根據本發明的優選實施方式，通過綁定相關基因到載體上獲得重組構建體。可通 過使用這類載體轉化宿主細胞將這些基因穩定地整合到宿主細胞基因組中。可使用重組細 胞系通過培養轉化體產生由這些基因編碼的多肽，從而在合適的培養基中獲得，從培養物 中分離表達的P0I，并使用適合表達產物的方法將其純化，特別是從污染蛋白中分離P0I。
[0243] 編碼POI的DNA序列也可可操作地連接到合適的終止子序列上，例如AOXl (醇氧 化酶）終止子、CYCl (細胞色素c)終止子、TEF (翻譯延長因子）終止子。
[0244] 表達載體可包括一種或多種表型選擇標記，例如編碼具有抗生素抗性的蛋白的基 因或者提供一營養缺陷要求的基因。酵母載體通常包含一來自酵母質粒的復制原點、一自 主復制序列（ARS)，或者一用于整合到宿主基因組中的序列、一啟動子區域、用于聚腺苷酸 化的序列、用于轉錄終止子的序列以及一選擇性標記。
[0245] 用于連接DNA序列的方法，例如分別用于連接編碼前導序列和/或POI的DNA序 列，啟動子和終止子的方法以及用于將它們插入到合適的載體中（該載體包含整合或宿主 復制的必需信息）的方法對于本領域技術人員來說是已知的，例如描述于"J. Sambrook et al.，''Molecular Cloning 2nd ed. 〃，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)
[0246] 可理解的是，本發明的載體可通過以下方法構建：首先制備包含載體所需元件的 整個DNA序列的DNA構建體，并將此構建體插入合適的表達載體；或者按順序插入包含各個 元件（例如信號、前導序列或P0I)的基因信息的DNA片段，然后進行連接。或者，表達組件 的各個元件也可通過PCR進行融合。
[0247] 本發明也可使用多克隆載體，其具有多克隆位點，其中可在多克隆位點結合所需 基因以提供一表達載體。在表達載體中，啟動子置于前導序列和POI的基因的上游，并調節 該基因的表達。在多克隆載體的情形下，因為前導序列和POI的基因是在多克隆位點被引 入，因此啟動子被置于多克隆位點的上游。該前導序列的基因可在PCR反應或合成制備中 融合到POI基因上，或者該前導序列的基因可提供于載體或表達組件中，并且該POI基因可 通過標準克隆方法引入。
[0248] 本發明提供的表達載體或組件和DNA構建體可通過已建立的標準方法，例如亞 磷酰胺方法進行合成制備。該DNA構造體還可以是基因組來源或cDNA來源的，例如通過 制備一基因組或cDNA文庫，并通過雜交篩選編碼本發明所有或部分多肽的DNA序列，該雜 交使用合成的寡核苷酸探針，并使用標準技術（Sambrook et al.，Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor, 1989)。最后，DNA構造體可以是合成來源和基因 組來源的混合、合成來源和cDNA來源的混合，或者基因組來源和cDNA來源的混合，其使用 標準技術通過使合成的、基因組的或cDNA來源的片段退火制備，該片段對應整個DNA構造 體的各個部分，視情況而定。
[0249] 根據本領域算法和技術的狀態（例如，由商業供應商提供的，如GeneArt、 GeneCust、GenScript或DNA2. 0)，對于本領域技術人員顯而易見的是，編碼前導序列和/或 POI的DNA序列可進行優化以使用宿主生物體偏好的密碼子。
[0250] 在另一優選的實施方式中，酵母表達載體或組件能夠穩定整合到酵母基因組中， 例如通過同源重組。
[0251] 本發明的一優選方面涉及這樣一種方法，其中表達載體或組件包含一前導序列， 其通過轉化的宿主細胞有效引起成熟POI的分泌。<