0068] ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCT
[0069] SEQ ID 16:用于實例9的核苷酸序列，獲自巴斯德巴斯德畢赤酵母CBS7435株，通 過使用實例9中描述的引物進行PCR擴增。
[0070] ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCT
[0071] SEQ ID17:獲自巴斯德畢赤酵母 DSMZ70382 株（German Collection of Microorganisms and Cell Cultures (德國微生物保藏和細胞培養中心））的核苷酸序列
[0072] ATGAAG1TCTC1ACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCAC1GTTGTCTCAGCT
[0073] 上述序列中的不同的核苷酸帶有下劃線。
[0074] SEQ ID 18:獲自巴斯德畢赤酵母CBS7435株（CBS-KNAW真菌生物多樣性中心， Centraalbureau voor Schimmelcultures，荷蘭烏得勒支）的核苷酸序列
[0075] ATGAAGCTCTCCACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTT GCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
[0076] SEQID 19 :用于實例5的核苷酸序列，獲自巴斯德畢赤酵母CBS7435株，通過使用 實例1和5中描述的引物進行PCR擴增
[0077] ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATTCTAGCTATTGCAGCAGCTTCCGCCGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTT GCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
[0078] SEQID20:獲自巴斯德畢赤酵母DSMZ70382株（德國微生物保藏和細胞培養中 心）的核苷酸序列
[0079] ATGAAGTTCTCTACCAATTTGATCTTAGCTATTGCAGCAGCATCCACTGTTGTCTCAGCTGCTCCAGTT GCTCCAGCCGAAGAGGCAGCAAACCACTTGCACAAGCGT
[0080] 特別地，本發明的核酸是DNA。
[0081] 特別地，本發明的前導序列是多肽。
[0082] 根據一個特定方面，本發明提供一分離的前導序列、截短前導序列、信號肽或前導 肽，優選地該前導序列具有一氨基酸序列，該氨基酸序列選自由SEQ ID 1、2、3、4、5、10、11、 12、13和14組成的組，優選排除SEQ ID 2。
[0083] 一特別優選的前導序列是一肽，該肽由SEQID3或SEQID 12的氨基酸序列組 成。
[0084] 根據另一方面，本發明進一步提供一包含一核酸的表達組件，該核酸編碼一前導 序列，該前導序列可操作地連接到一編碼POI的核酸序列上，其特征在于，該前導序列選自 由以下組成的組：
[0085] a)具有SEQID 10的氨基酸序列的前導肽或其具有一個或兩個點突變的功能變 體，
[0086] b)具有選自由SEQ ID 11、12、13和14組成的組的氨基酸序列的前導肽，
[0087]c)具有SEQID 1的氨基酸序列的信號肽，或者其具有一個或兩個點突變的功能 變體，以及
[0088] d)具有選自由SEQID2、3、4和5組成的組的氨基酸序列的信號肽，
[0089] 優選地，其中排除由SEQID2氨基酸序列組成的信號肽和包含一種或多種免疫球 蛋白單可變域（或由其組成）的多肽的融合體，例如納米抗體。
[0090] 然而，根據具體實例，本發明提供具有選自由SEQ ID 11、12、13和14組成的組的 氨基酸序列的前導肽與一 POI的融合體，或者提供具有選自由SEQ ID 2、3、4和5組成的組 的氨基酸序列的信號肽與一 POI的融合體，該POI選自由生長因子、激素、細胞因子、抗體和 抗體片段組成的組，特別地，其中抗體或抗體片段選自由以下組成的組：scFv、微抗體、雙特 異抗體、三特異抗體、四特異抗體、Fab、Fc-融合蛋白和全長抗體例如IgG、IgA、IgD、IgM或 Ig，優選的是一全長抗體、scFv或Fab，特別包括由SEQ ID 2氨基酸序列組成的信號肽與這 類抗體或抗體片段的任一種，特別是全長抗體、scFv或Fab中的任一種的融合體。
[0091] 編碼用于表達組件的信號肽或前導肽的特別優選的核苷酸序列由編碼SEQ ID 3 或SEQ ID 12的氨基酸序列的核苷酸序列組成，優選地，由SEQ ID 16或SEQ ID 19,或者 SEQ ID 16或19的密碼子優化的變體組成。這類信號肽或前導肽優選地融合到任意P0I， 包括任意抗體或抗體片段，特別包括由SEQ ID 3或SEQ ID 12的氨基酸序列組成的信號肽 或前導肽與一多肽的融合，該多肽包含一個或多個免疫球蛋白單可變域，或由其組成，例如 一納米抗體。
[0092] 根據另一方面，本發明進一步提供一表達組件，包括
[0093] a)編碼信號肽的核苷酸序列，選自由SEQ ID 15、16和17組成的組，或者
[0094] b)編碼前導肽的核苷酸序列，選自由SEQ ID 18、19和20組成的組，或者
[0095] c) 一核苷酸序列，其為SEQ ID 15、16、17、18、19或20的密碼子優化的變體，
[0096] 優選地，其中排除通過將SEQ ID 15的核苷酸序列融合到編碼一種或多種免疫球 蛋白單可變域的核苷酸序列的融合構建體，例如納米抗體。
[0097] 然而，根據一特定實例，本發明提供將SEQ ID 15的核苷酸序列融合到編碼一抗體 或抗體片段的核苷酸序列的融合構建體，該抗體或抗體片段選自由以下組成的組：scFv、微 抗體、雙特異抗體、三特異抗體、四特異抗體、Fab、Fc-融合蛋白和全長抗體例如IgG、IgA、 IgD、IgM或IgE，優選的是一全長抗體、scFv或Fab。
[0098] 特別優選的核苷酸序列是SEQ ID 16,編碼SEQ ID 3的信號肽。
[0099] 另一特別優選的核苷酸序列是SEQ ID 19,編碼SEQ ID 12的前導肽。
[0100] 因此，根據具體實例，本發明提供將SEQ ID 16或19的核苷酸序列融合到編碼任 何目標蛋白的核苷酸序列的融合構建體，特別地，該目標蛋白是例如本文描述的P0I，包括 但不限于，任意抗體或抗體片段，特別包括融合構建體，其中POI是一多肽，包括一個或多 個免疫球蛋白單可變域，或由其組成，例如一納米抗體。
[0101] 通過本發明的表達組件，第一次可以提供POI的表達，特別是分泌的成熟POI的表 達，具有正確的、天然的N末端氨基酸殘基，特別是在N末端不具有另外的丙氨酸。
[0102] 具體來說，POI選自：治療性蛋白，包括抗體或其片段、酶和肽類、蛋白質抗生素、 毒素融合蛋白、碳水化合物-蛋白質結合物，結構蛋白、調節蛋白、疫苗和類疫苗蛋白或顆 粒、過程酶（process enzymes)、生長因子、激素和細胞因子，或者其中所述POI介導宿主細 胞代謝物的產生，代謝物優選選自由抗體或其片段、生長因子、激素和細胞因子組成的組。
[0103] 根據特定實例，該抗體或其抗體片段選自由以下所組成的組：scFv、微抗體、雙特 異抗體、三特異抗體、四特異抗體、Fab、Fc-融合蛋白和全長抗體例如IgG、IgA、IgD、IgM或 IgE，優選的是一全長抗體、scFv或Fab。
[0104] 特別地，本發明的表達組件是本發明的核酸和一編碼POI的核酸的融合體，并因 此是一非天然存在的核酸。本發明進一步提供本發明的前導序列與POI的融合蛋白，并因 此是一非天然存在的融合蛋白。
[0105] 因此，前導序列經改造用于改善POI的生產，例如，用于增加分泌量和改善質量， 例如正確的N末端，并且采用了不同于現有技術的前導序列。
[0106] 本發明的表達組件特別地編碼一前導序列，該前導序列由信號肽或通過原序列 (pro-sequence)延長的信號肽組成，該原序列由APVAPAEEAANHLHKR(SEQ ID 7)組成，該 原序列是巴斯德畢赤酵母Epxl蛋白的天然全長前導序列的一部分，即與SEQ ID 8(MKFST NLILAIAAASTVVSAAPVAPAEEAANHLHKRAYYTDITKTHTFTEVVTVYRT)的 57 個氨基酸序列中的第 21-36個氨基酸序列相同的16個氨基酸序列。
[0107] 與現有技術的前導序列例如SEQ ID 21相比，本發明的兩個前導序列，信號肽和截 短肽意外地具有意料之外的改善的性能，其中，
[0108] SEQ ID 21：MKLSTNLILAIAAASAVVSAA,
[0109] 根據US2011/0021378A1，本文中也稱為EpxL-AA (21個氨基酸）。
[0110] 此外，與EP2258855A1中描述的巴斯德畢赤酵母Epxl蛋白的全長前導序列相比， 本發明顯示出改善的性能，該全長前導序列是SEQ ID 8的57個氨基酸序列或在其位置3 用亮氨酸進行取代的變體。
[0111] 這更令人驚訝，因為根據本發明，該沒有原序列的20個氨基酸的信號肽或者該截 短前導序列的長度分別僅為全長前導序列的35%和63%。
[0112] 與用a交配因子（a MF)前導序列進行融合相比，本發明的前導序列融合到POI 之時具有特殊優勢，例如POI分泌增加，和/或質量提高，例如正確的N末端，特別是當POI 是激素、細胞因子、抗體或抗體片段時，例如選自由以下組成的組：scFv、微抗體、雙特異抗 體、三特異抗體、四特異抗體、Fab、Fc-融合蛋白和全長抗體例如IgG、IgA、IgD、IgM或IgE， 優選的是一全長抗體、scFv或Fab。
[0113] 本發明的表達組件明確地排除如EP2258855A1中描述的編碼巴斯德畢赤酵母 Epxl蛋白的天然前導序列（SEQ ID 8)的核酸。
[0114] 本發明的表達組件進一步明確排除一核酸，該核酸編碼具有巴斯德畢赤酵母Epxl 蛋白全長前導序列的第1-21個氨基酸的前導序列（即SEQ ID 11)，如US2011/0021378A1 中所述的。
[0115] 根據本發明的一個特殊方面，表達組件可選地結合到一表達構建體上，例如一載 體。
[0116] 根據本發明的進一步的特殊方面，表達組件或者表達構建體包含一啟動子，其可 操作地連接到編碼該前導序列的核酸上。
[0117] 根據本發明的一特定實施例，本發明提供一重組酵母宿主細胞，其包括本發明的 表達組件，特別是酵母宿主細胞系，更特別的是一生產細胞系。根據本發明的一特定方面， 該表達組件是一載體，或者載體的一部分。
[0118] 優選地，酵母選自以下種屬：畢赤酵母屬、假絲酵母屬、球擬酵母屬、Arxula酵母、 漢遜氏酵母、Ogatea酵母、耶氏酵母屬、克魯維酵母屬、裂殖酵母屬、Komagataella酵母，優 選的是一甲醇營養型酵母，并且特別優選的是巴斯德畢赤酵母、Komagataella pastoris、 K.phaffii 或 K. pseudopastoris。
[0119] 根據另一【具體實施方式】，本發明提供在酵母宿主細胞內生產POI的方法，包括：
[0120] -提供本發明的宿主細胞，
[0121] -培養所述宿主細胞以表達所述POI，以及
[0122] -純化POI以獲得純化的POI制品。
[0123] 根據本發明，優選地采用表達組件以便于重組基因在酵母宿主細胞內的分泌，從 而增加分泌產物的產量。
[0124] 因此，本發明的表達組件提供宿主細胞內的POI的高效表達和分泌，該宿主細胞 用所述表達組件進行轉化。在這方面，本發明的表達組件理解為酵母表達組件。
[0125] 特別地，該POI是一重組蛋白，該術語在本文中總是理解為包括多肽和蛋白，例如 由重組宿主細胞產生的那些。該POI可以是異源蛋白，例如與酵母異源的，例如獲自較高級 的真核生物如人類，或除巴斯德畢赤酵母以外的其他酵母種的蛋白，或者是人工多肽或蛋 白。或者，POI可以是一同源蛋白，其獲自酵母例如巴斯德畢赤酵母，其在沒有被本發明載 體轉化的天然酵母內不表達或表達量不夠，但其在本發明的重組酵母宿主細胞內達到理想 的表達量例如過量表達以產生大量POI或代謝產物。
[0126] 具體而言，POI具有一氨基酸序列，該序列具有一天然的N末端氨基酸序列。所述 POI優選包含一氨基酸序列，其不包括額外的丙氨酸作為N末端氨基酸殘基。具體而言，該 POI不具有額外