[0036] 用于使用允許獲得含有非常低量的殘余的污染性的酶（甚至低至3ppm)的綴合肽 或蛋白的微生物谷氨酰胺轉移酶（M-TGase)催化的反應獲得經過谷氨酰胺的酰胺鍵合與 親水性非免疫原性聚合物綴合的高度純的治療肽或重組蛋白的純化方法。
[0037] 有利地，綴合的（優選地聚乙二醇化）肽或蛋白已經被證明示出非常高的穩定性 (當在5±3°C下儲存時持續不小于36個月），因此可以被用作藥物。由于意料之外的高純 度，肽或蛋白和聚合物之間的酶催化的酰胺鍵鍵合的裂解不會發生，因此提供了可以有利 地被用作藥物的穩定的產品。
[0038] 作為證實在小于4. 0的pH下進行的純化的優點的實施例，在圖8中報道了關于通 過TGase聚乙二醇化制造、通過在不同pH下的陽離子交換色譜法純化和在冰箱中儲存24 和36個月的聚乙二醇化Met-G-CSF的4個批次的穩定性數據。在高于4. 0的pH下純化并 且含有多于3ppm的殘余的TGase的批次08BK01和08BK02在儲存24個月之后示出高的量 的脫酰胺化Met-G-CSF (>1% )。在pH 4. 0下純化并且含有5ppm的殘余的谷氨酰胺轉移酶 的批次08105,盡管比批次08BK01和08BK02更穩定，但在儲存36個月后示出明顯的量的 脫酰胺化Met-G-CSF(0. 2% )。在小于4. 0的pH下純化并且含有不可檢測的量的殘余的 TGase (<3ppm)的批次LP070424是最穩定的批次并且在冰箱中儲存36個月之后也未示出可 檢測的脫酰胺化Met-G-CSF的含量。
[0039] 在優選的方面中，根據本發明的綴合蛋白通過在治療性蛋白和親水性聚合物優選 地親水性非免疫原性聚合物之間的由微生物谷氨酰胺轉移酶催化的酶促反應獲得。
[0040] 治療性蛋白可以優選地選自由 素、Fab和scFv抗體片段、胰高血糖素、GLP-I、胰島素和其衍生物以及類似物組成的組。
[0041] 親水性非免疫原性聚合物可以以優選的形式選自由聚乙二醇、聚丙烯酰嗎啉、聚 乙烯吡咯烷酮和羥乙基淀粉組成的組。
[0042] 在更優選的方面中，綴合蛋白通過在Met-G-CSF和氨基-聚乙二醇之間的由微生 物谷氨酰胺轉移酶催化的酶促反應獲得，從而允許獲得Met-G-CSF-Glnl35-PEG。
[0043] 根據本發明的綴合蛋白具有在從2°C至8°C范圍內、優選地5°C的溫度下呈現出至 少36個月的儲存期的優點。
[0044] 這樣的儲存期是意料之外的并且之前未曾通過具有殘余的MTGase污染物的現有 技術的蛋白獲得，所述殘余的MTGase污染物在綴合反應之后存在并且在其儲存期間降解 綴合的藥物（圖8)。
[0045] 本發明涉及用于通過陽離子交換色譜法純化綴合蛋白的方法，所述綴合蛋白通過 經由谷氨酰胺轉移酶的酶促反應獲得，所述方法包括以下的步驟：
[0046] a.使陽離子交換色譜柱達到小于4的pH;
[0047] b.將色譜柱裝載有在步驟a.的柱上具有小于4的pH的含有綴合蛋白的反應混合 物；
[0048] c.將步驟b.的色譜柱用具有小于4的pH的洗脫劑洗脫，
[0049] 從而收集含有具有低于或等于綴合蛋白的總量的3ppm的殘余的微生物谷氨酰胺 轉移酶含量的綴合蛋白的級分，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下呈現出至少 36個月的儲存期。
[0050] 本發明的方法具有允許獲得具有高度純度和低于或等于3ppm的殘余的微生物谷 氨酰胺轉移酶含量的聚乙二醇化蛋白的優點，這轉而允許藥物穩定性的明顯改進。在由本 發明提供的方法中，谷氨酰胺轉移酶與聚乙二醇化產物以令人驚訝地有效的方式被分離。 此意外的結果通過使用以pH〈4. 0的酸性洗脫劑進行從反應物和污染性的酶的綴合肽或蛋 白的陽離子交換純化獲得。在此PH值下，在聚乙二醇化蛋白和酶之間沒有非共價的相互作 用，并且因此避免通過聚乙二醇化蛋白保留部分酶。
[0051] 在優選的方面中，根據本發明的方法的步驟a.、b.和c.的pH是在從3至3. 9的 范圍內，優選地pH 3. 8,甚至更優選地pH 3. 5。
[0052] 為了本發明的目的：
[0053]-術語"綴合蛋白"指的是被共價地附接至親水性聚合物優選地親水性非免疫原性 聚合物的蛋白或肽。例如親水性非免疫原性聚合物可以是聚乙二醇、聚丙烯酰嗎啉、聚乙烯 吡咯烷酮和羥乙基淀粉。
[0054] -術語"Met-G-CSF-Glnl35-PEG"指的是在谷氨酰胺135處綴合至聚乙二醇的甲硫 氨酰化的粒細胞集落刺激因子。
[0055]-術語"聚乙二醇化蛋白"或"聚乙二醇化肽"指的是被共價地附接至聚乙二醇 (PEG)聚合物鏈的蛋白或肽。
[0056]-術語"治療肽或蛋白衍生物"指的是全部或部分地保持天然序列的生物學活性的 氨基酸鏈。
[0057]-術語"蛋白或肽或其同系物"指的是具有與對應的天然肽或蛋白的氨基酸序列至 少90%相同的氨基酸序列的蛋白或肽變體。在此上下文中，蛋白或肽的氨基酸序列變型可 以是由于天然序列的一個或更多個氨基酸的添加、減去、取代或化學修飾。
[0058]-術語"合適的生物相容的聚合物"指的是用于酶促的綴合反應的任何聚合物并且 意味著當通過全身途徑施用時相同的綴合的聚合物不誘導免疫激活，也不明顯地引起特異 性的抗聚合物抗體。被包括在本發明中的生物相容的聚合物的實例是聚乙二醇（PEG)、聚氧 丙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯酰嗎啉、多糖和右旋糖酐。
[0059]-術語"通過微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)催化的反應綴合至生物相容的聚合 物的治療肽或重組蛋白"指的是通過使用MTGase共價地連接至合適的生物相容的聚合物以 便增加肽或蛋白的半衰期的任何臨床上有用的蛋白或肽以及其同系物或變體。術語治療肽 指的是通過化學合成或通過重組DNA技術制備的小于50個殘基的氨基酸序列。
[0060] 在更優選的方面中，根據本發明的方法的步驟a.和b.的pH用乙酸鹽緩沖液，優 選地30mM乙酸鹽緩沖液獲得。
[0061] 在又更優選的方面中，根據本發明的方法的步驟c.的pH用乙酸鹽緩沖液，優選地 200mM乙酸鹽緩沖液獲得。
[0062] 在另外的方面中，在根據本發明的方法的裝載步驟b.之后，色譜柱用以色譜柱的 體積的4倍的體積的乙酸鹽緩沖液，優選地30mM乙酸鹽緩沖液洗滌。
[0063] 在另外的方面中，根據本發明的方法的步驟b.的反應混合物通過在治療性蛋白 和親水性聚合物優選地親水性非免疫原性聚合物之間的由微生物谷氨酰胺轉移酶催化的 酶促反應獲得。
[0064] 在本發明的另外的方面中，治療性蛋白選自由粒細胞集落刺激因子（G-CSF)和其 臨床上使用的變體例如Met-G-CSF(非格司亭）、粒細胞巨噬細胞集落刺激因子（GM-CSF); 干擾素（IFN);人生長激素（h-GH);白細胞介素、單克隆抗體片段例如Fab和scFv片 段；胰島素；胰高血糖素和腸促胰島素模擬肽例如胰高血糖素類肽l(GLP-l)、艾塞那肽 (exenatide)和其衍生物以及類似物組成的組。
[0065] 在本發明的另外的方面中，親水性非免疫原性聚合物選自由聚乙二醇（PEG)、聚丙 烯酰嗎啉（PAM)、聚乙烯吡咯烷酮（PVP)和羥乙基淀粉組成的組。
[0066] 在更優選的方面中，通過根據本發明的方法獲得的綴合蛋白是聚乙二醇化蛋白并 且通過在Met-G-CSF和氨基-聚乙二醇之間的由微生物谷氨酰胺轉移酶催化的酶促反應獲 得，從而允許獲得 Met-G-CSF-Gln 135-PEG。
[0067] 根據本發明的方法有利地允許獲得在5°C的溫度下呈現出至少36個月的儲存期 的綴合蛋白。
[0068] 在另外的方面中，本發明涉及通過本文描述的方法獲得的綴合蛋白、優選地聚乙 二醇化蛋白。
[0069] 通過在小于4的pH下的陽離子交換色譜方法可獲得的綴合蛋白在2°C至8°C范圍 內的溫度下有利地呈現出至少36個月的儲存期。
[0070] 在又另外的方面中，本發明涉及包含綴合蛋白和藥學上可接受的賦形劑的藥物組 合物。
[0071] 特此描述用于從通過微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)在谷氨酰胺側鏈處經過酰 胺鍵合酶促地綴合至親水性非免疫原性聚合物的肽或重組蛋白移除殘余的谷氨酰胺轉移 酶的方法。產生的純化的綴合肽或蛋白對肽或蛋白部分和親水性聚合物之間的酰胺鍵的酶 促水解是穩定的并且沒有產物衍生的降解，展示了藥物所需的穩定性。
[0072] 本發明的優選的實施方案被例證，但不以任何方式受限于關于用于通過在低pH