蛋白綴合物的制作方法
【專利說明】蛋白綴合物 發明領域
[0001] 本發明涉及適于產生具有改進的血漿半衰期的藥物的綴合肽的領域。特別地，本 發明涉及通過經由微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)的酶促反應獲得的綴合蛋白、和用于 制備高度純的綴合蛋白的改進的方法，所述高度純的綴合蛋白沒有產物衍生的降解并且呈 現出改進的儲存期。 現有技術
[0002] 與生物相容的、高分子量的聚合物綴合是用于增加治療肽或蛋白的半衰期和用于 改進其持久性效果的最常用技術之一。特別地，在已經被廣泛利用的所謂的聚乙二醇化反 應中，將選擇的蛋白共價地結合至具有從1，000-2, 000道爾頓（Da)至20, 000-40, OOODa或 甚至更高的分子量的一種或更多種線性的或支化的聚乙二醇（PEG)鏈。通常，聚乙二醇化 蛋白示出較低的腎清除率、以及較高的穩定性和減少的免疫原性。當多肽與PEG合適地結 合時，其流體力學體積增加并且其物理化學性質被修改，而諸如體外活性或受體識別的基 本的生物學功能可以保持不變、經歷減少或在一些情況下完全被根除。PEG綴合掩蔽了蛋 白表面并且增加其表觀分子尺寸，因此減小腎超濾，防止與抗體或抗原呈遞細胞（antigen processing cell)相互作用并且減少蛋白水解降解。最后，PEG綴合向聚乙二醇化分子賦 予其物理化學性質并且因此肽和非肽藥物生物分布和溶解度也被修改。用于蛋白綴合的另 一選擇（作為PEG的替代方案）是利用其它線性的或支化的生物相容性聚合物，諸如例如 右旋糖酐、聚（乙烯吡咯烷酮）、聚（丙烯酰嗎啉）、聚多糖等等。
[0003] 聚乙二醇化通常通過氨基酸反應性側鏈和合適地官能化的甲氧基-PEG(m-PEG) 之間的化學反應來進行。
[0004] 通常利用的化學聚乙二醇化技術在以下出版物中描述：
[0005] -S. Zalipsky,Chemistry of Polyethylene Glycol Conjugates with Biologically Active Molecules, Adv. Drug Deliv. Rev. , 16?157-182?1995 ；
[0006] -F. M. Veronese, Peptide and Protein PEGylatioma Review of Problems and Solutions，Biomaterials，22,405-417, 2001。
[0007] -S. Jevsevar, M. Kunstel j, V. G. Porekar, PEGylation of therapeutic proteins，Biotechnol. J. 5,113 - 128, 2010。
[0008] 除了化學聚乙二醇化之外，結合m-PEG鏈和蛋白的酶促程序已經被描述。例如， 這些基于利用原核和真核起源兩者的谷氨酰胺轉移酶類以催化將用伯氨基官能化的m-PEG 轉移至感興趣的多肽鏈中天然存在的或通過位點特異性誘變反應插入的谷氨酰胺殘基的 酉先基（H. Sato, Enzymatic Procedure for Site-Specific PEGylation of ProteinsjAdv. Drug Deliv. Rev.，54,487-504, 2002) 〇
[0009] 例如，EP785276和US6010871二者描述使用微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)將 聚合物鏈連接至在其氨基酸序列中具有至少一個谷氨酰胺殘基的肽和蛋白。在這些專利 中，盡管給出了在一些模型蛋白上的單取代的實例，但不清楚的是取代是否也是位點特異 性，這意指它們產生單分子形式或位置異構體的混合物，在位置異構體的混合物中，盡管被 單取代，聚合物鏈與不同的谷氨酰胺結合。
[0010] 在另一方面，EP2049566和US7893019二者公開通過使用MTGase的酶促反應在谷 氨酰胺135處選擇性地單聚乙二醇化的新的G-CSF類似物。
[0011] 然而，上文報道的專利和論文中不重視由酶促反應產生的聚乙二醇化產物的純化 方法，特別地考慮到產物中污染性的殘余的MTGase的量，所述殘余的MTGase意外地仍然能 夠水解綴合的PEG分子并且產生產物衍生的異質性。
[0012] 正日益感到對開發允許維持穩定的治療性蛋白（therapeutic protein)的方法的 需求和重要性。
[0013] 因此，本發明的目的是開發允許減少在綴合反應之后存在并且在其儲存期間降解 綴合的藥物的殘余的MTGase污染物的方法。
[0014] 發明概述
[0015] 本發明涉及通過經由微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)的酶促反應獲得的綴合蛋 白，其特征在于以下事實：在純化的產物中殘余的MTGase的含量不高于3p. p. m，所述綴合 蛋白在2°C至8°C范圍內的溫度下呈現出至少36個月的儲存期。
[0016] 在另外的方面中，本發明涉及用于通過陽離子交換色譜法純化通過經由谷氨酰胺 轉移酶的酶促反應獲得的綴合蛋白的方法。
[0017] 如將在發明詳述中另外描述的，本發明的方法具有允許獲得高度純的綴合的治療 性蛋白的優點。
[0018] 根據本發明，用于純化綴合蛋白的方法包括以下的步驟：
[0019] a.使陽離子交換色譜柱達到小于4的pH;
[0020] b.將色譜柱裝載有在步驟a.的柱上具有小于4的pH的含有聚乙二醇化蛋白的反 應混合物；
[0021] c.將步驟b.的色譜柱用具有小于4的pH的洗脫劑洗脫，
[0022] 從而收集含有具有低于或等于綴合蛋白的總量的3ppm的殘余的微生物谷氨酰胺 轉移酶含量的綴合蛋白的級分（fraction)，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下 呈現出至少36個月的儲存期。
[0023] 本發明的另外的方面是通過本文描述的方法可獲得的綴合蛋白和包含所述綴合 蛋白和藥學上可接受的賦形劑的藥物組合物。
[0024] 附圖簡述
[0025] 從下文報道的詳細描述、從被給出用于例證性和非限制性的目的的實施例以及從 所附的圖1-8中，本發明的特征和優點將是明顯的，其中：
[0026] 圖1:示出MTGase的RP-HPLC熒光測定。MTGase的RP-HPLC熒光測定。校正曲線 (a)和在7. 3min時熒光底物CBZ-Gln-Gly-CAD-DNS從在8.Omin時熒光產物CBZ-Gln(Gly-CAD-DNS) -Q-NH-CH2-CH2-0-Me的RP-HPLC分離（b)。
[0027] 圖2:示出在MTGase存在下在約30min后（a)和在16小時后（b)的Met-G-CSF和 mPEG-NH2 20kDa的反應混合物的SE-HPLC色譜圖，所述色譜圖示出Met-G-CSF(以11. 5min 的保留時間洗脫）被聚乙二醇化以給出Met-G-CSF-Glnl35-PEG 20kDa(保留時間7. 9min)。 在13min洗脫的峰是由于溶劑前沿。
[0028] 圖3:示出在pH 5下MTGase從Macrocap SP柱的洗脫圖。
[0029] 圖4:示出在pH 5下聚乙二醇化Met-G-CSF和MTGase從Macrocap SP柱的洗脫 圖。
[0030] 圖5:示出在MTGase分離級分26-40 (a)中和在聚乙二醇化Met-GCSF+MTGase級 分21-58 (b)和級分66-75 (c)中的殘余的MTGase的RP-HPLC熒光測定。
[0031] 圖6 :示出在50ppm的MTGase存在下在5°C下儲存1個月之前（a)和之后（b)的 純化的 r-Met-G-CSF-Q135-PEG 20kDa 的 IE-HPLC。Met-G-CSF 在 7. 5-8. Imin 洗脫的畸峰 是由于溶劑前沿洗脫的假象。
[0032] 圖7 :示出在室溫下用50ppm的MTGase處理L 5小時之前（a)和之后（b)的純化 的 r-Met-G-CSF 的 IE-HPLC。
[0033] 圖8:示出通過TGase介導的聚乙二醇化產生并且通過在不同pH下的陽離子交換 色譜法純化的Met-G-CSF-Glnl35-PEG的穩定性數據。
[0034] 發明詳述
[0035] 本發明涉及通過經由微生物谷氨酰胺轉移酶（MTGase)的酶促反應獲得的綴合 蛋白，其特征在于以下事實：在純化的產物中殘余的MTGase的含量不高于5p. p. m、優選地 3p. p. m，所述綴合蛋白在從2°C至8°C范圍內的溫度下呈現出至少24個月、優選地至少36 個月的儲存期。