糖苷酶抑制劑及其用圖
【專利說明】糖苷酶抑制劑及其用途 發明領域
[0001] 本發明涉及抑制糖苷酶的化合物及其用途。
[0002] 發明背景
[0003] 許多不同的細胞蛋白（細胞核和細胞質兩者）是通過添加經由0-糖苷鍵連接的 單糖2-乙酰氨基-2-脫氧-e -D-吡喃葡萄糖苷（e -N-乙酰葡糖胺）而進行翻譯后修飾 、此修飾通常被稱為〇-連接的N-乙酰葡糖胺或0-GlcNAc。負責使0 -N-乙酰葡糖胺 (GlcNAc)翻譯后連接至許多核質蛋白的特異性絲氨酸和蘇氨酸殘基的酶為O-GIcNAc轉移 酶（OGT)2A被稱為糖蛋白2-乙酰氨基-2-脫氧-0 -D-吡喃葡萄糖苷酶（0-GlcNAcase)6' 7的第二酶除去該翻譯后修飾以釋放出蛋白，使得0-GlcNAc-修飾成為在蛋白壽命期間多次 發生的動態循環 8。
[0004]O-GlcNAc-修飾的蛋白調節許多重要的細胞功能，包括例如轉錄9_12、蛋白酶體降 解13和細胞信號轉導14。在許多結構蛋白上也發現了 O-GlcNAc1547。例如，其已在許多細胞 骨架蛋白上被發現，包括神經絲蛋白18' 19、突觸蛋白6'2°、突觸蛋白-特異性網格蛋白裝配蛋 白AP-3 7和錨定蛋白G 14。已在腦中發現豐富的O-GIcNAc修飾21'22。其還已經在明確涉及 幾種疾病（包括阿爾茨海默病（AD)和癌癥）的病因學的蛋白上被發現。
[0005] 例如，完全確定的是，AD和許多相關tau蛋白病，包括唐氏綜合征、皮克氏癥、尼 曼-皮克氏C型癥和肌萎縮性側索硬化癥（ALS)，部分地以神經原纖維纏結（NFT)的發展為 特征。這些NFT為成對螺旋絲樣結構（PHF)的聚集體，且由異常形式的細胞骨架蛋白"tau" 組成。tau通常穩定微管的關鍵細胞網絡，其為神經元內分配蛋白和營養素所必需的。然 而，在AD患者中，tau變得過度磷酸化，擾亂其正常功能，形成PHF且最終聚集形成NFT。在 人腦中發現了 tau的6種同種型。在AD患者中，tau的所有6種同種型皆在NFT中被發現， 且所有6種皆顯著地過度磷酸化23' 24。在健康的腦組織中的tau僅攜帶2或3個磷酸酯基 團，而在AD患者腦中發現的tau平均攜帶8個磷酸酯基團 25'26。在AD患者腦中的NFT水 平與癡呆癥的嚴重性之間明確的平行性強力地支撐tau功能障礙在AD中的關鍵作用 27_29。 tau的這種過度磷酸化的確切原因仍然難以捉摸。因此，相當大的努力曾經致力于：a)闡明 tau過度磷酸化的分子生理基礎 3°;及b)鑒別能限制tau過度磷酸化的策略，希望這些策略 可以停止或甚至逆轉阿爾茨海默病的進展^34。到目前為止，雖然最近已提出這種過度磷酸 化的替代基礎 21，一些證據跡象表明，許多激酶的上調可能涉及tau的過度磷酸化21'35' 36。
[0006] 具體地，已經出現了通過tau上的O-GlcNAc水平來調節tau的磷酸酯水平。在tau 上存在的O-GIcNAc已經激勵了將O-GIcNAc水平與tau磷酸化水平相關聯的研宄。在該領 域的興趣起源于以下的觀察：已經發現O-GIcNAc修飾出現于許多蛋白上已知經歷磷酸化 的氨基酸殘基處37^39。與此觀察一致的是，已經發現磷酸化水平的提高導致降低的O-GlcNAc 水平，而相反地，提高的O-GIcNAc水平與降低的磷酸化水平相關聯4°。O-GIcNAc與磷酸化 之間的這種彼此相反的關系已被稱為"陰-陽（Yin-Yang)假設"41，且已經通過酶OGT 4與 用于從蛋白除去磷酸酯基團的磷酸酶一起形成功能性復合物的發現而得到強力的生化支 持42。像磷酸化一樣，O-GIcNAc為能夠在蛋白壽命期間被除去和重建數次的動態修飾。提 示性地，已將編碼O-GlcNAcase的基因標定成與AD連接的染色體位點7' 43。在人AD腦中過 度磷酸化的tau具有明顯比健康人腦中所發現的更低的O-GIcNAc水平21。已經表明，來自 患有AD的人腦的可溶性tau蛋白的O-GlcNAc水平，明顯低于那些來自健康腦部的可溶性 tau蛋白的O-GlcNAc水平 21。還表明，來自患病腦部的PHF完全毫無任何O-GlcNAc修飾 21。tau的這種低糖基化的分子基礎是未知的，雖然其可能起源于增加的激酶活性和/或參 與加工O-GIcNAc的酶之一的功能障礙。在小鼠的PC-12神經細胞和腦組織切片兩者中支 持該后一觀點，使用了非選擇性N-乙酰葡萄糖胺酶抑制劑來提高tau O-GIcNAc水平，此時 觀察到磷酸化水平降低21。這些共同的結果暗示，通過維持AD患者中的健康O-GIcNAc水平 (諸如通過抑制O-GlcNAcase的作用），應該能阻斷tau的過度磷酸化和tau過度磷酸化的 所有相關效應，包括形成NFT和下游效應。然而，因為0-氨基己糖苷酶恰當發揮功能至關 重要，所以用于AD治療的阻斷O-GlcNAcase作用的任何潛在治療介入，必須避免伴隨抑制 氨基己糖苷酶A和B。
[0007] 神經元不儲存葡萄糖，因此腦部依賴由血液供給的葡萄糖來維持其基本的代謝功 能。尤其地，已經表明腦內的葡萄糖攝取及代謝隨著變老而降低 44。在AD患者的腦內發生 顯著降低的葡萄糖利用性，且被認為是神經變性的潛在原因45。這種AD腦中的降低的葡萄 糖供給的基礎 46_48被認為起源于降低的葡萄糖輸送49'5°、受損的胰島素信號轉導 51'52和降低 的血流量53中任何一個。
[0008] 鑒于這種受損的葡萄糖代謝，值得注意的是進入細胞中的所有葡萄糖中2-5%被 分流至己糖胺生物合成途徑中，從而調節該途徑的最終產物（尿苷二磷酸-N-乙酰葡萄 糖胺（UDP-GlcNAc))的細胞濃度 54。UDP-GlcNAc為核質酶O-GIcNAc轉移酶（OGT)的底 物2_5,其用于翻譯后添加GIcNAc至許多核質蛋白的特異性絲氨酸和蘇氨酸殘基中。OGT 通過其三角形四肽重復（TPR)結構域 58'59識別許多其底物55'56及結合伴侶42' 57。如上所 述，0-GlcNAcase6'7除去該翻譯后修飾以釋放出蛋白，使得O-GlcNAc-修飾成為在蛋白壽 命期間多次發生的動態循環 8。已經在若干蛋白中已知的磷酸化位點上發現了 0-GlcNAc10' 38'39'6°，包括tau和神經纖維絲 61。另外，OGT表現出不尋常的動力學行為，使其對細胞內 UDP-GlcNAc底物濃度極其敏感，并因此對葡萄糖供給極其敏感 42。
[0009] 與己糖胺生物合成途徑的已知特性、OGT的酶特性及O-GIcNAc與磷酸化之間彼此 相反的關系一致的是，已經證明腦中降低的葡萄糖利用率造成tau過度磷酸化 45。因此，逐 漸受損的葡萄糖輸送和代謝（不管其原因如何）造成O-GIcNAc降低和tau(及其它蛋白） 的過度磷酸化。因此，抑制O-GlcNAcase應當補償在健康對象以及患有AD或相關神經變性 疾病患者的腦內與年齡相關的葡萄糖代謝受損。
[0010] 這些結果表明，調節tau O-GlcNAc水平的機制功能失常在形成NFT和相關神經變 性中可能非常重要。阻斷tau過度磷酸化作為治療上有用的介入的良好支持 62來自最近的 研宄，所述研宄表明當攜帶人類tau的轉基因小鼠被激酶抑制劑處理時，它們并未發展成 典型的運動缺陷 34,而在另一實例中33,表明不可溶性tau的水平降低。這些研宄提供了在 這種疾病的小鼠模型中，降低tau磷酸化水平與減輕AD樣行為癥狀之間清晰的關聯。事實 上，對tau過度磷酸化進行藥理調節被廣泛認定為治療AD和其它神經變性病癥的有效治療 策略 63。
[0011] 限制tau過度磷酸化的小分子O-GlcNAcase抑制劑已被考慮用于治療AD和有關 tau蛋白病64。具體地，所述O-GlcNAcase抑制劑thiamet-G已經涉及在培養的PC-12細 胞中的病理相關位點上降低tau磷酸化64。此外，向健康Sprague-Dawley大鼠口服施用 thiamet-G已經涉及在大鼠皮質和海馬體兩者中Thr231、Ser396和Ser422上降低tau磷 酸化64。
[0012] 還有大量的證據表明，O-GlcNAc蛋白修飾的水平提高提供了對心臟組織中應激反 應的致病效應的保護，所述應激包括由局部缺血、出血、低血容量性休克和鈣反常所引起的 應激。例如，通過施用葡糖胺來活化己糖胺生物合成途徑（HBP)，已證明在局部缺血/再灌 注65'創傷性出血 72'低血容量性休克75和鈣反常65'76的動物模型中發揮保護效應。此 外，強有力的證據表明，升高水平的蛋白O-GIcNAc修飾介導這些心臟保護效應65'66'68' 71'73' 76,〇還存在的證據是，O-GIcNAc修飾在包括帕金森氏癥和亨廷頓氏癥在內的各種神經變 性疾病中發揮作用8°。
[0013] 人類有三種編碼裂解糖綴合物的末端e-N-乙酰葡糖胺殘基的酶的基因。這些 基因中的第一種基因編碼O-GlcNAcase。O-GlcNAcase為糖苷水解酶的家族84中的成員， 所述家族包括來自從原核生物病原至人的各種有機體的酶（對于糖苷水解酶的家族分類， 參見 Coutinho, P. M. &Henrissat，B. (1999) Carbohydrate-Active Enzymes server 在 URL : http://afmb. cnrs-mrs. fr/CAZY/ 上 81'82)。O-GlcNAcase 用于水解以除去翻譯后修飾的蛋 白上絲氨酸和蘇氨酸殘基的0-GlcNAc1'6' 7'83'84。與O-GlcNAc存在于許多細胞內蛋白上一致 的是，該O-GlcNAcase酶看來在幾種疾病的病因學中發揮作用，包括II型糖尿病 14'85、AD16' 21'86和癌癥 22'87。雖然有可能在更早之前分離