包含具有非經典生物活性的組氨酰-tRNA合成酶剪接變異體的組合物及方法
【專利說明】包含具有非經典生物活性的組氨酰-tRNA合成酶剪接變異 體的組合物及方法
[0001] 相關專利申請的交叉引用
[0002] 本申請根據35U.S.C. § 119(e)主張于2009年3月16日提交的美國臨時專利申 請61/160, 630和于2009年9月3日提交的美國臨時專利申請61/239, 747的權益，所述專 利申請的全部內容通過援引并入本文中。
[0003] 關于序列表的說明
[0004] 與本申請有關的序列表以文本格式提供，代替書面版本，并通過援引并入本說明 書中。含有所述序列表的文本文件名稱為120161_415PC_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文 件大小為20KB，于2010年3月16日創建，并通過EFS-Web電子提交。
[0005] 發明背景 發明領域
[0006] 本發明大體上涉及組氨酰-tRNA合成酶（HRS)剪接變異體多核苷酸和多肽，包含 這些多核苷酸和多肽的組合物及其使用方法。
[0007] 相關技術說明
[0008] 催化tRNA分子氨酰化的氨酰-tRNA合成酶（AARS)蛋白質，對翻譯過程中解碼遺 傳信息是必不可少的。每個真核tRNA合成酶由與原核tRNA合成酶密切相關的核心酶， 以及添加到氨基末端、羧基末端或插入到核心酶內部的其他結構域組成。例如，人類酪氨 酰-tRNA合成酶（TyrRS)具有不屬于原核和低等真核生物TyrRS分子部分的羧基末端結構 域。
[0009] 已經證實有幾個氨酰-tRNA合成酶具有不同于其參與翻譯過程的非經典功能。例 如，微型酪氨酰-tRNA合成酶（mini-TyrRS)，即對應于第1-364位氨基酸殘基、被多形核細 胞彈性蛋白酶和纖溶酶切割的TyrRS的N端結構域，是氨酰-tRNA合成酶（AARS)多功能 細胞因子樣蛋白質和肽的成員。已證明微型-TyrRS在體外刺激中性粒細胞激活和趨化作 用，刺激內皮細胞增殖和遷移，并在雞胚絨毛尿囊膜（CAM)和小鼠基質膠檢測（matrigel assay)中促血管生成。微型-TyrRS具有ELR基序，所述ELR基序和諸如IL-8的CXC-趨化 因子類似，可賦予微型-TyrRS趨化因子活性和血管生成活性。和其他含ELR的細胞因子類 似，所述基序的突變抑制微型-TyrRS對白細胞的結合和刺激，并抑制血管生成。
[0010] 此外，已證明TrpRS的截短形式具有血管生成性能。在正常人體細胞中，有兩種可 檢測的TrpRS形式：由全長分子（第1-471位氨基酸殘基）組成的主要形式和次要的截短 形式。次要形式是通過前體mRNA(pre-mRNA)的可選剪接而使氨基末端結構域缺失所產生 的。已確定微型TrpRS的氨基末端為全長TrpRS分子第48位的蛋氨酸殘基。或者，截短 TrpRS可以通過蛋白水解產生。例如，牛TrpRS在胰臟中高表達并分泌到胰液中，從而導致 產生截短的TrpRS分子。進一步的研究表明，微型-TrpRS抑制VEGF誘導的細胞增殖和遷 移（Wakasugietal.，Proc.Natl.Acad.Sci. 99:173-177(2002))。具體而言，雞CAM實驗 表明，微型-TrpRS可阻止VEGF的血管生成活性。相比之下，全長TrpRS不抑制血管生成。 因此，去除前48位氨基酸殘基可顯現出TrpRS抗血管生成活性。因此，與TyrRS-樣，某些 形式的TrpRS具有除tRNA氨酰化以外的活性。
[0011]鑒于這些與可變形式TyrRS和TrpRS相關的、非經典的治療相關活性的觀察結果， 需要鑒定其他氨酰-tRNA合成酶蛋白質的生物相關形式和/或活性，以開發該蛋白質家族 的全部治療潛力。因此，本發明滿足這些需要，并提供其他相關的優點。
[0012] 發明概述
[0013] 本發明大體上涉及具有非經典活性的分離的HRS剪接變異體多肽；編碼HRS剪接 變異體多肽的HRS剪接變異體多核苷酸；與HRS多肽結合的結合劑；HRS多肽和多核苷酸的 類似物、變異體和片段，以及前述任一物質的組合物和其制備和使用方法。
[0014] 因此，根據一個方面，本發明提供具有至少一種非經典生物活性的分離的HRS剪 接變異體多肽，及其活性片段和變異體。本文所用的"非經典"活性，一般是指本發明HRS 多肽所具有的除氨酰化以外的活性，更具體地說，除了將組氨酸添加到tRNAms分子上以外 的活性。如本文所述，在某些實施方案中，本發明HRS多肽所顯示的非經典生物活性可以包 括，但不僅限于，細胞因子產生調節、細胞增殖調節、凋亡調節、細胞信號傳導調節、血管生 成調節、細胞遷移調節、細胞結合調節、細胞代謝調節等。
[0015] 在一個說明性實施方案中，本發明HRS剪接變異體多肽是至少包含HRS的WHEP結 構域，如人類全長HRS蛋白質的第3-43位氨基酸殘基，的HRS片段。在另一個實施方案中， 本發明HRS剪接變異體多肽是至少包含HRS的反密碼子結合結構域，如人類全長HRS蛋白 質的第406-501位氨基酸殘基的HRS片段。在又一個實施方案中，HRS剪接變異體多肽是 缺失功能性氨酰化結構域，如人類全長HRS蛋白質的第54-398位氨基酸殘基的HRS片段。 在一個更具體的實施方案中，HRS剪接變異體多肽至少包含WHEP結構域和反密碼子結合結 構域，但缺失功能性氨酰化結構域。
[0016] 在一個更具體的實施方案中，本發明HRS多肽包含SEQIDN0 6、9或11中公布的 序列，或者是SEQIDN0 6、9或11所示序列或是的SEQIDN0 6、9或11所示多肽的連續 片段。需要說明的是，所述片段實質上可以基本上是任意長度的，只要其保留至少一種感興 趣的非經典生物活性。例如，如本文進一步所述,這樣的片段可以包含SEQIDN0 6、9或11 的至少約5、10、15、20、25、50、75、80或更多個連續氨基酸殘基。
[0017] 在本發明的其他實施方案中，HRS多肽包含SEQIDN0s:6、9或11所示序列的活 性變異體（即保留至少一個感興趣的非經典生物活性）。在一個更具體的實施方案中，活性 變異體是一種沿著其長度與SEQIDN0 6、9或11所示序列具有至少70%、80%、90%、95% 或99%同一性的多肽。
[0018] 在另一個具體實施方案中，本發明HRS多肽不是由全長人類HRS蛋白第1-48位殘 基組成的多肽。
[0019] 根據本發明的另一個方面，提供了至少包含至少一個本文所述的HRS多肽和一個 異源融合伴侶的融合蛋白。
[0020] 根據本發明的另一個方面，提供了編碼本文所述多肽和融合蛋白的分離的多核苷 酸，以及包含這種多核苷酸的表達載體和包含這種表達載體的宿主細胞。此外，還包括與 HRS多核苷酸特異性雜交的寡核苷酸，如SEQIDN0:5、8或10的多核苷酸。在某些實施方 案中，寡核苷酸為引物、探針或反義寡核苷酸。其他實施方案涉及靶向HRS多核苷酸的RNAi 劑（RNAiagents)。在某些實施方案中，寡核苷酸或RNAi劑與HRS剪接變異體特有的剪接 點特異性地雜交，或靶向所述剪接點。
[0021] 根據本發明的另一個方面，提供了對本發明HRS剪接變異體多肽（例如，SEQID N0:6、9或11)具有結合特異性的結合劑（例如，抗體和其抗原結合片段），或其細胞結合伴 侶之一。在某些實施方案中，所述結合劑為抗體、所述抗體的抗原結合片段、肽、肽模擬物、 小分子或適體。在一些實施方案中，所述結合劑拮抗HRS多肽的非經典活性。在其他實施 方案中，所述結合劑促進HRS多肽的非經典活性。
[0022] 根據本發明的又一個方面，提供了包含生理上可接受的載體和至少一個本文所述 的本發明的分離的多肽、融合蛋白、抗體、分離的多核苷酸、表達載體、宿主細胞等的組合 物，如藥物組合物。
[0023] 此外，還包括確定樣品中HRS剪接變異體的多核苷酸序列的存在或水平的方法， 所述方法包括使樣品接觸與SEQID N0:5、8或10所示的HRS剪接變異體特異性雜交的一 種或更多種寡核苷酸，檢測樣品中寡核苷酸存在與否，并由此確定HRS剪接變異體的多核 苷酸序列的存在或水平。
[0024] 還提供了確定樣品中HRS剪接變異體的多核苷酸序列存在或水平的方法，包括使 樣品與至少兩種特異性擴增SEQIDN0s:5、8或10所示的HRS剪接變異體的寡核苷酸接 觸，進行擴增反應，檢測擴增產物存在與否，并由此確定HRS剪接變異體的多核苷酸序列的 存在或水平。在一些實施方案中，寡核苷酸與HRS剪接變異體特有的剪接點特異性地結合， 或特異性地擴增所述剪接點。某些實施方案包括將HRS剪接變異體的存在或水平與對照樣 品或預定值比較。具體實施方案包括表征樣品的狀態，使其區分于對照。在具體實施方案 中，所述樣品和對照包括細胞或組織，所述方法包括區分不同種類的細胞或組織、不同組織 或器官的細胞、不同細胞發育狀態的細胞、不同細胞分化狀態的細胞或健康和病變細胞。
[0025] 還包括鑒定與SEQID N0s:6、9或11所示的HRS剪接變異體多肽或一種或更多種 HRS剪接變異體多肽的細胞結合伴侶特異性結合的化合物的方法，其包括a)使HRS多肽或 其細胞結合伴侶或這兩者與至少一種測試化合物在適當條件下結合，和b)檢測HRS多肽或 其細胞結合伴侶或這兩者與所述測試化合物的結合，從而鑒定與HRS多肽或其細胞結合伴 侶或這兩者特異性結合的化合物。在某些實施方案中，所述測試化合物為多肽或肽、抗體或 抗體的抗原結合片段、肽模擬物或小分子。在一些實施方案中，測試化合物促進HRS多肽或 其細胞結合伴侶的非經典生物活性。在其他實施方案中，測試化合物拮抗HRS多肽或其細 胞結合伴侶的非經典生物活性。此外，還包括由本文所提供的任意方法所識別的化合物。
[0026] 在其他方面，本發明還提供了通過使細胞或組織與本文所述的本發明組合物接觸 而調節細胞活性的方法。例如，在某些實施方案中，待調節的細胞活性選自細胞因子產生、 細胞增殖、凋亡、細胞信號傳導、細胞代謝、血管生成、細胞遷移、細胞結合等。在一個具體實 施方案中，所述方法是調節細胞因子產生的方法。在一個更具體的實施方案中，所述方法是 調節IL-2產生和/或分泌的方法。在一些實施方案中，所述方法是調節TNF-a產生和/ 或分泌的方法。在其他實施方案中，所述方法是調節MIPl-a產生和/或分泌的方法。
[0027] 在某些實施方案中，所述細胞活性為細胞因子受體活性。在具體的實施方案中，所 述細胞因子受體是CCR1。在某些實施方案中，所述細胞活性為細胞遷移。一些實施方案包 括減少單核細胞的細胞遷移。在某些實施方案中，所述細胞活性為通過Toll樣受體（TLR) 的細胞信號傳導。
[0028] 在其他方面，本發明提供了通過給予本發明的組合物而治療有需要的個體的疾 病、病癥或其他狀況的方法。舉例來說，這類疾病、病癥或狀況可以包括，但不僅限于，癌癥、 炎性疾病、免疫疾病（包括自身免疫疾病）和/或與異常血管生成相關的狀況。
[0029] 在某些實施方案中，所述狀況是神經系統狀況。在具體實施方案中，神經系統狀況 與6-羥基多巴胺（6-OHDA)誘導的神經元死亡相關。在某些實施方案中，所述狀況是炎性 疾病。在具體的實施方案中，所述炎性疾病是關節炎性痛風或炎性腸疾病。
[0030] 還在其他方面，本發明的多肽、抗體和/或其他組合物實質上可用于本領域內已 知及可用的任何類型的篩選試驗。例如，本發明的組合物（例如，多肽、多核苷酸和/或抗 體）實質上可以與任何已知的篩選方法結合使用，以鑒定順應本發明療法的合適的細胞類 型和/或疾病狀況。在其他實例中，本發明的組合物（例如，多肽、多核苷酸和/或抗體） 可以與已知的篩選方法結合使用，以鑒定直接或間接介導或調節本文組合物的非經典活性 的結合伴侶、競爭性抑制劑和/或其他細胞效應子。例如，在具體的實施例中，提供了鑒定 測試化合物的篩選方法，所述測試化合物作為本發明組合物與所述組合