培養(yǎng)首次達(dá)到80%~90%融合度后的顯微鏡觀察照片，圖8B為細(xì)胞培養(yǎng)首次達(dá)到 80%~90%融合度后細(xì)胞計(jì)數(shù)照片；圖8C為P1代細(xì)胞顯微鏡觀察照片；
[0026] 圖9為本發(fā)明的實(shí)施例4中獲得細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果；
[0027] 圖10為本發(fā)明的實(shí)施例5中不同首次換液時(shí)間的細(xì)胞培養(yǎng)第3天和第5天的顯 微鏡觀察照片。
【具體實(shí)施方式】
[0028] 本發(fā)明的脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法是將分離的單個(gè)干細(xì)胞進(jìn)行增 殖培養(yǎng)的方法。
[0029] 單個(gè)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的分離方法為：
[0030] 配制P型膠原酶母液：100ml生理鹽水加入lgP型膠原酶，混勻后過濾，然后再用 生理鹽水將P型膠原酶母液稀釋成終濃度為0. 1~1% (m/v)。
[0031] 獲取脂肪組織：由專業(yè)的醫(yī)院或美容機(jī)構(gòu)通過腫脹法吸脂手術(shù)獲得患者腹部淺表 層的脂肪組織，獲取的脂肪組織裝入20ml注射器內(nèi)存放，維持在2~8°的環(huán)境中運(yùn)輸，12 小時(shí)內(nèi)進(jìn)行分離操作，其中，患者經(jīng)篩查合格，即HBV抗原、抗HCV抗體、抗HIV抗體、抗梅毒 螺旋體抗體、ALT、支原體檢測(cè)項(xiàng)目均為陰性。
[0032] 洗滌脂肪組織：將脂肪組織放入離心管內(nèi)，20ml/管，補(bǔ)加生理鹽水至40ml，離心 200rpm，3min，棄下層血水，重復(fù)上述步驟一次。
[0033] 消化脂肪組織：取10ml脂肪組織，加入等體積的0. 1~1 % (m/v)的P型膠原酶 充分混勻，37°C150rpm震蕩消化8~50min。
[0034] 離心收集：消化產(chǎn)物經(jīng)150目篩網(wǎng)過濾，收集細(xì)胞初懸液，將細(xì)胞初懸液經(jīng) 1500rpm、10min，1200rpm、10min，1000rpm、10min三次梯度離心后，取離心得到的沉淀即脂 肪間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0035] 本發(fā)明采用的無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/ F12,添加物包含：血清替代物2~15% (v/v)、維生素C20~100ug/ml、人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子 0? 5~10ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子5~20ng/ml、L-谷氨酰胺1~5mmol/ml。
[0036] 人血小板源生長(zhǎng)因子（Plateletderivedgrowthfactor，roGF)是一個(gè)具有雙 鏈結(jié)構(gòu)的蛋白多肽，是血小板分泌的主要絲裂原，是一個(gè)極為重要的、隨血循環(huán)而行、作用 于間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)因子。它直接促進(jìn)正常細(xì)胞的增殖和分化。人血小板源生長(zhǎng)因子有 BB、AB、AA三種類型，本發(fā)明采用PDGF-BB。
[0037]干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（StemCellGrowthFactors。SCGF)是美國(guó)AgingOff Biotech，Inc.聯(lián)合哈弗大學(xué)、賓夕法尼亞大學(xué)、匹茲堡大學(xué)、麻省理工大學(xué)等機(jī)構(gòu)共同開放 的一種具有刺激自體內(nèi)源性干細(xì)胞生長(zhǎng)的高效蛋白質(zhì)、酶組合，也是體外培養(yǎng)干細(xì)胞必不 可少的各種細(xì)胞生長(zhǎng)因子的組合，富含表皮生長(zhǎng)因子（EGF)、纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（FGF)、神 經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF)、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF)、血小板源性生長(zhǎng) 因子（PDGF)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF)等多重有效成分。
[0038] 血清替代物（UltroserG)包含6類真核生物細(xì)胞生長(zhǎng)所必須的物質(zhì)，包括生長(zhǎng)因 子、粘附因子、荷爾蒙、結(jié)合蛋白、維生素、微量礦物元素等，它的生物活性遠(yuǎn)高于血清。血清 替代物一般為液體狀態(tài)。
[0039] 無血清培養(yǎng)基的各組分來源及用量如表1所示。
[0040]表1
[0041]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，包括以下步驟： 將分離的單個(gè)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)首次全量換 液； 然后繼續(xù)采用所述無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，將干 細(xì)胞接種于無血清培養(yǎng)基時(shí)加入慶大霉素。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12,所述添加物包含： 血清替代物2~15% (v/v)、維生素 C20~100ng/ml、人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子0· 5~10ng/ml、 人血小板源生長(zhǎng)因子5~20ng/ml、L-谷氨酰胺1~5mmol/ml。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，所述 無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和添加物組成，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為DMEM/F12,所述添加物包含： 血清替代物5% (v/v)、維生素 C 50ug/ml、人干細(xì)胞生長(zhǎng)因子2ng/ml、人血小板源生長(zhǎng)因子 20ng/ml，L-谷氨酰胺 2mmol/ml。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，包括 以下步驟： 將分離的單個(gè)干細(xì)胞以〇. 5~I X IOVcm2的密度接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入無血清培養(yǎng)基， 然后置于37 °C、飽和濕度、CO2體積分?jǐn)?shù)為5 %的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)； 細(xì)胞培養(yǎng)24h后換液，去掉殘余的血細(xì)胞和雜細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)，每三天全量換液； 待細(xì)胞達(dá)到80 %~90 %融合度，用0. 9 %的生理鹽水洗滌細(xì)胞表面，加入0. 075 %~ 0. 125% (m/v)的胰蛋白酶進(jìn)行消化； 將消化后的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi)，1200~1800rpm，離心6~8min，將離心所得的沉淀 用無血清培養(yǎng)基重懸，按1 :3的比例接種進(jìn)行傳代培養(yǎng)，將Pl代細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)和凍存。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，其特征在于，將干 細(xì)胞接種于無血清培養(yǎng)基時(shí)加入200IU慶大霉素。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪原始間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖培養(yǎng)方法，包括以下步驟：將分離的單個(gè)干細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶，加入無血清培養(yǎng)基，細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)首次全量換液；然后繼續(xù)采用無血清培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。無血清培養(yǎng)基不引入外源蛋白質(zhì)，使培養(yǎng)的細(xì)胞利于臨床應(yīng)用，培養(yǎng)24小時(shí)首次全量換液，能夠充分去除殘余雜細(xì)胞，有利于純化干細(xì)胞。
【IPC分類】C12N5-0775
【公開號(hào)】CN104830762
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510219210
【發(fā)明人】吳炯
【申請(qǐng)人】廈門中領(lǐng)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司
【公開日】2015年8月12日
【申請(qǐng)日】2015年4月30日