脂肪原始間充質干細胞的增殖培養方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及細胞培養領域，特別涉及一種脂肪原始間充質干細胞的增殖培養方 法。
【背景技術】
[0002] 干細胞是一類具有自我更新能力且在適合微環境下具有多系分化潛能的原始細 胞。根據個體發育過程中出現的先后次序不同，干細胞可分為胚胎干細胞，多能干細胞以及 各種組織中的定向干細胞如造血干細胞、神經干細胞等。目前，已有利用干細胞治療心肌梗 塞、紅斑狼瘡、類風濕性關節炎、神經損傷、肌肉萎縮等的實驗報道。
[0003] 成體干細胞是存在于人體組織中具有多系分化潛能的一種原始干細胞群，在特定 環境下可誘導分化成多種組織細胞。在成體干細胞中，間充質干細胞廣泛存在于全身各種 組織中，特別是骨髓，脂肪，臍帶和胎盤。由于脂肪來源的間充質干細胞具有強大的增值能 力，較強的分化能力，低免疫原性和免疫調節功能，其在臨床上的應用價值越來越受人們關 注。
[0004] 中國專利ZL201210336264. 5公開了一種"人脂肪干細胞的分離培養方法和干細 胞庫的構建方法"，該方法在進行細胞培養時，培養較長時間才首次換液，不利于純化干細 胞，且其在培養基中加入了高濃度的胎牛血清，增加了培養成本，也引入了外源動物蛋白， 使培養的細胞不利于臨床應用。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的是提供一種利于純化干細胞、不引入外源蛋白質、有利于臨床應用 的脂肪原始間充質干細胞的增殖培養方法。
[0006] 為實現上述目的，根據本發明的一個方面，提供了一種脂肪原始間充質干細胞的 增殖培養方法，包括以下步驟：將分離的單個干細胞接種于培養瓶，加入無血清培養基，細 胞培養24小時首次全量換液；然后繼續采用無血清培養基進行細胞培養。由此，無血清培 養基不引入外源蛋白質，使培養的細胞利于臨床應用，培養24小時首次換液，能夠充分去 除殘余雜細胞，有利于純化干細胞。
[0007] 在一些實施方式中，將干細胞接種于無血清培養基時加入慶大霉素。由此，慶大霉 素是一種氨基糖苷類抗生素，主要用于治療細菌感染，尤其是革蘭氏陰性菌引起的感染。 慶大霉素能與細菌核糖體30s亞基結合，阻斷細菌蛋白質合成。慶大霉素與其他抗生素相 比（頭孢類，青霉素類）具有良好的熱穩定性，較低的過敏人群等優點。
[0008] 在一些實施方式中，無血清培養基由基礎培養基和添加物組成，基礎培養基為 DMEM/F12,添加物包含：血清替代物2~15% (v/v)、維生素C20~100ug/ml、人干細胞生長 因子0? 5~10ng/ml、人血小板源生長因子5~20ng/ml、L_谷氨酰胺1~5mmol/ml。由此， 無血清培養基的各組分能夠為細胞培養提供良好的條件，使培養脂肪源的間充質干細胞具 有細胞周期短、增殖能力強、細胞均一性好、純度高的特點，有效的抑制干細胞的分化和內 皮細胞的貼壁生長，保證干細胞的純度和干性，另外該培養基不含胎牛血清等動物源成分， 通過該培養基獲得的干細胞適合于臨床應用。
[0009] 在一些實施方式中，無血清培養基由基礎培養基和添加物組成，基礎培養基為 DMEM/F12,添加物包含：血清替代物5% (v/v)、維生素C50ug/ml、人干細胞生長因子2ng/ ml、人血小板源生長因子20ng/ml，L-谷氨酰胺2mmol/ml。由此，上述無血清培養基的組分 含量能夠使細胞具有最優的增殖效果。
[0010] 在一些實施方式中，脂肪原始間充質干細胞的增殖培養方法，包括以下步驟：
[0011] 將分離的單個干細胞以0. 5~IX104/cm2的密度接種于培養瓶內，加入無血清培 養基，然后置于37°C、飽和濕度、C02體積分數為5 %的培養箱內培養；
[0012] 細胞培養24h后換液，去掉殘余的血細胞和雜細胞，繼續培養，每三天全量換液；
[0013] 待細胞達到80 %~90 %融合度，用0.9%的生理鹽水洗滌細胞表面，加入 0. 075 %~0. 125% (m/v)的胰蛋白酶進行消化；
[0014] 將消化后的細胞轉移到離心管內，1200~1800rpm，離心6~8min，將離心所得的 沉淀用無血清培養基重懸，按1 :3的比例接種進行傳代培養，將P1代細胞進行檢測和凍存。
[0015] 由此，上述細胞增殖培養步驟簡單、花費時間短，能夠有效純化干細胞，保證干細 胞的純度和干性，獲得的干細胞適合于臨床應用。
[0016] 在一些實施方式中，將干細胞接種于無血清培養基時加入200IU慶大霉素。由此， 上述劑量的慶大霉素具有良好的抗菌效果。
[0017] 本發明的有益效果為：本發明的無血清培養基能夠使培養的脂肪源的間充質干細 胞具有細胞周期短、增殖能力強、細胞均一性好、純度高的特點，有效的抑制干細胞的分化 和內皮細胞的貼壁生長，保證干細胞的純度和干性，另外該培養基不含胎牛血清等動物源 成分，通過該培養基獲得的干細胞適合于臨床應用。本發明細胞培養24小時首次換液，能 夠充分去除殘余雜細胞，有利于純化干細胞。采用慶大霉素為接種細胞的抗菌，與其他抗生 素相比（頭孢類，青霉素類）具有良好的熱穩定性，較低的過敏人群等優點。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發明的實施例1的步驟S2中細胞培養24h后顯微鏡觀察照片；
[0019] 圖2為本發明的實施例1中細胞培養過程中的顯微鏡觀察照片，其中，圖2A為 細胞培養首次達到80%~90%融合度后的顯微鏡觀察照片，圖2B為細胞培養首次達到 80%~90%融合度后細胞計數照片；圖2C為P1代細胞顯微鏡觀察照片；
[0020] 圖3為本發明的實施例1中獲得細胞流式檢測結果；
[0021] 圖4為本發明的實施例2中細胞培養過程中的顯微鏡觀察照片，其中，圖4A為 細胞培養首次達到80%~90%融合度后的顯微鏡觀察照片，圖4B為細胞培養首次達到 80%~90%融合度后細胞計數照片；圖4C為P1代細胞顯微鏡觀察照片；
[0022] 圖5為本發明的實施例2中獲得細胞流式檢測結果；
[0023] 圖6為本發明的實施例3中細胞培養過程中的顯微鏡觀察照片，其中，圖6A為 細胞培養首次達到80%~90%融合度后的顯微鏡觀察照片，圖6B為細胞培養首次達到 80%~90%融合度后細胞計數照片；圖6C為P1代細胞顯微鏡觀察照片；
[0024]圖7為本發明的實施例3中獲得細胞流式檢測結果；
[0025] 圖8為本發明的實施例4中細胞培養過程中的顯微鏡觀察照片，其中，圖8A為 細胞