一種用于卵母細胞、皮膚成體干細胞培養的組合物及應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種用于卵母細胞、皮膚成體干細胞培養的組合物及應用。
【背景技術】
[0002] 卵母細胞（oocyte)在母體的卵巢上產生。卵巢上濾泡（follicle)包括卵母細胞 與濾泡細胞（follicularcells)。在濾泡的生長過程中，初級卵母細胞（primaryoocyte) 停止在減數分裂第一次成熟分裂的前期，當青春期開始，在濾泡刺激素（FSH)的作用下，祖 細胞初級卵母細胞體積增大，并在卵母細胞的外周形成透明帶，濾泡細胞生長成多層細胞， 包圍卵母細胞，并在濾泡中形成濾泡腔，故稱次級濾泡（secondaryfollicle)。在成熟濾泡 中，初級卵母細胞在激素LH和其他因子的作用下，完成第一次減數分裂，形成次級卵母細 胞，或成熟的卵母細胞，并排放第一極體，極體位于卵母細胞與透明帶之間的卵周隙中。這 是濾泡壁破裂，卵母細胞從成熟的濾泡中排出，加入輸卵管。如果輸卵管中存在能活的精 子，就會發生受精，產生受精卵（fertilizedegg)，或稱胚胎（embryo)。胚胎經過分裂與發 育變成囊胚，并迀移到母體的子宮著床，形成胎兒（fetus)。
[0003] 初級卵母細胞屬于卵母細胞的祖細胞，它會在一定因子的作用下，定向的分化成 成熟的卵母細胞，并具有受精的能力。生育期的婦女，每隔28天左右排放一個卵子，偶爾排 放兩個或多個卵子。奶牛與人類一樣，是單胎動物，每次一般排放一個卵子。其他的動物屬 于多胎動物，如綿羊，山羊每次會排放3~5個卵子，家豬，家兔，小鼠，大鼠會排放8~10個，或 更多的卵子。不管是單胎或者多胎動物，在每個排卵周期中，有一批（20~100個）的卵母祖 細胞啟動定向分化為成熟卵母細胞的過程。同時原始濾泡向初級濾泡，以及次級濾泡的生 長與發育。在此過程中，單胎動物的卵巢上大量卵母細胞都會出現細胞的凋亡（programmed death)，導致閉鎖的濾泡（atresic follicles)，只有一個卵母細胞排卵，其他的卵母細胞 都會凋亡而退化，無法排卵或排卵但無法受精。多胎動物的卵巢上，同樣出現卵母細胞的凋 亡與退化。這樣會造成大量卵母細胞的損失，也是造成人類不孕不育的原因之一。
[0004] 體外受精技術（i/?n'trofertilization，IVF)是繁殖生物學中最有成就的技術， 其中卵母細胞的體外成熟（i/?ritromaturation，IVM)技術，就是將卵母祖細胞能夠最大 限度地降低其細胞凋亡的過程，并向成熟卵母細胞的方向分化，保證卵子的正常受精，發育 成胚胎，從而增加可受孕的胚胎質量與數量。
[0005] 雖然體外受精技術得到了廣泛地應用，但胚胎成熟比例仍然很低，主要受以下幾 個方面的影響： 1)卵母細胞的體外成熟率低，即細胞核的成熟與細胞質的成熟程度較低。
[0006] 2)受精卵向胚胎發育的過程中： 卵子的分裂率低； 胚胎發育到桑椹和囊胚的比率低。
[0007] 為此，我們提供了一種組合物，該組合物能夠促進卵母細胞的體外成熟培養，促進 體外受精的受精卵向胚胎發育。同時，我們通過動物皮膚組織與細胞培養的實驗，發現該組 合物能夠促進皮膚成體干細胞再生與增殖。
[0008] 皮膚有極強的修復和再生能力，這與皮膚成體干細胞（skinadultstemcells) 的存在具有直接的關系。目前，皮膚成體干細胞的臨床應用主要表現在幾個方面： (1)在細胞治療中的應用。當皮膚受到外傷、疾病等的損傷時，位于皮膚表皮基底層和 毛囊隆突的皮膚成體干細胞就會在內外源因素的調控下，及時增殖分化生成相關細胞，以 修復機體受損表皮、毛囊等結構。
[0009] (2)在組織工程中的應用。人工真皮是利用組織工程技術形成商品化用于臨床的 真皮替代物，它可誘發正常的皮膚愈合過程，已用于治療大面積燒傷病人的暫時性皮膚覆 蓋及慢性皮膚潰瘍的治療。
[0010] (3)在基因治療中的應用。干細胞因具有高度自我更新和多向分化潛能，因此一直 為基因治療首選的靶細胞。將表皮干細胞作為皮膚遺傳性疾病等基因治療的靶細胞已成為 可能。將外源基因通過逆轉錄病毒導入表皮成體干細胞并植入體內后，機體可長期維持轉 導基因的表達，這就為表皮成體干細胞應用于基因治療提供了可靠的依據。
[0011] 上述應用均涉及皮膚成體干細胞的體外擴增、培養，然而皮膚成體干細胞體外培 養中易分化為成纖維細胞，使得自體皮膚成體干細胞和由自體皮膚成體干細胞構造的人造 皮膚的應用在臨床上較難實現，上述組合物的應用能夠有效解決這一問題。
【發明內容】
[0012] 針對上述問題，本發明提供了一種用于卵母細胞、皮膚成體干細胞培養的組合物 及應用，該組合物能夠提高卵母細胞的體外成熟率，并提高卵子的分裂率、胚胎發育到桑椹 和囊胚的比率，進而大幅促進體外受精的受精卵向胚胎發育。同時，該組合物能夠有效抑制 皮膚成體干細胞向成纖維細胞分化，或維持皮膚成體干細胞的自我更新與再生。
[0013] 半胱胺（cysteamine)，又稱2-巰基乙胺或巰基乙胺。分子式：C2H7NS，分子量： 77. 14,屬于一種滲透性強的小分子，還原劑，具有抗氧化的作用。尤其是當機體皮膚受到紫 外光或X線照射時，細胞產生大量的游離羥基（0H)，半胱胺與游離羥基作用，從而產生極 強的抗氧化作用，達到保護皮膚的機能以及維護機體的生理平衡。
[0014]Rho激酶抑制劑Y27632,分子量320. 26,是一個Rho相關激酶ROCK的抑制劑。 Y27632具有防止細胞凋亡，并提高分離的人類胚胎干細胞存活率和克隆效率的功能，并可 提高胚胎干細胞源性神經前體移植的存活率。
[0015] 白血病抑制因子（LeukemiaInhibitorFactor,LIF)是一種可以通過抑制自身 分化來促進胚胎干細胞長期維持的淋巴因子，主要應用于胚胎干細胞的體外培養和研宄。 LIF可與胚胎干細胞表面的LIFR/gpl30受體結合，通過幾個重要的信號通路起作用：LIF激 活JAK/STAT通路抑制ES細胞分化；LIF激活PI3K通路維持ES細胞的自我更新；LIF激活 MAPK(MitogenActivatedProteinKinase，分裂原激活蛋白激酶）級聯通路。
[0016] 本發明提供了一種用于卵母細胞以及皮膚成體干細胞培養的組合物，其包括半胱 胺。
[0017] 進一步地，所述組合物還包括LIF。
[0018] 進一步地，所述組合物還包括LIF和Y27632。
[0019] 更進一步地，所述組合物中半胱胺、LIF和Y27632配比為（Immol-lOOmmol): (10IU-103IU):(0?lmmol-lOmmol)。
[0020] 本發明提供了一種用于卵母細胞、IVF受精卵或IVF胚胎培養的培養液或培養基， 其特征在于：包含上述技術方案中任一所述的組合物。
[0021] 進一步地，所述組合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培養液或培養基中半 胱胺濃度為10-200mM，白血病抑制因子濃度為102-2X103IU/mL; 所述組合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制劑Y27632,所述培養液或培 養基中半胱胺濃度為10-200禮，白血病抑制因子濃度為102-2X103IU/mL，Rho激酶抑制 劑Y27632濃度為1-20禮。
[0022] 本發明提供了上述技術方案中任一所述的組合物在卵母細胞體外成熟培養、IVF 受精卵或IVF胚胎體外培養中的應用。
[0023] 進一步地，所述組合物包含半胱胺和白血病抑制因子，所述培養液或培養基中半 胱胺濃度為10-200mM，白血病抑制因子濃度為102-2X103IU/mL; 所述組合物包含半胱胺、白血病抑制因子和Rho激酶抑制劑Y27632,所述培養液或培 養基中半胱胺濃度為10-200禮，白血病抑制因子濃度為102-2X103IU/mL，Rho激酶抑制 劑Y27632濃度為1-20禮。
[0024] 進一步地，所述卵細胞、IVF受精卵或IVF胚胎選自人或下述任何一種動物：山羊、 綿羊、奶牛、豬，家兔、小鼠、大鼠或豚鼠。
[0025] 本發明提供了一種用于皮膚成體干細胞培養的培養液，包含上述技術方案中任一 所述的組合物。
[0026] 進一步地，所述培養液或培養基中半胱胺濃度為5-500mM，LIF濃度為50-5X103 IU/mL，Y27632 濃度為 0? 5-50mM。
[0027] 本發明提供了上述技術方案中任一所述的組合物在皮膚成體干細胞、皮膚組織培 養中的應用。
[0028] 進一步地，培養液或培養基中半胱胺濃度為5-500mM，LIF濃度為50-5X103IU/ mL，Y27632 濃度為 0? 5-50mM。
[0029] 本發明提供了上述技術方案中任一所述的組合物在制備治療創傷性皮膚缺損、皮 膚潰瘍的藥物或試劑中的應用。
[0030] 進一步地，所述藥物或試劑中半胱胺濃度為5-500mM，LIF濃度為50-5X103IU/ mL，Y27632 濃度為 0? 5-50mM。