短的acs4蛋白，其包含SEQ ID N0:1或其變體 的第1-450位、第1-400位、第1-350位、第1-300位、第1-250位或第1-203位氨基酸。
[0103] 本發明還涉及含有編碼cDNA(mRNA)的內源性acs4基因的番茄種子、植物和植物 部分，所述cDNA(mRNA)與SEQ ID N0:8具有基本序列同一性并且在所述內源性acs4基因 具有至少一個非轉基因突變，其中所述至少一個非轉基因突變導致產生與野生型Acs4蛋 白相比acs4蛋白功能喪失或活性降低的突變acs4蛋白。優選地，與編碼SEQ ID NO: 1的 蛋白或其功能性變體的功能性野生型Acs4等位基因純合型的番茄相比，所述突變導致降 低的乙烯產生和/或更加緩慢的果實成熟和/或更長的貯藏期。本文任何位置中描述的突 變可以是人工誘導的或其可以是自然突變。優選地，所述植物是栽培的番茄植物。在一個 實施方案中，所述突變產生終止密碼子或氨基酸置換。在一個實施方案中，選自野生型Acs4 蛋白的Ala248、Val250、Ser279、Thr316和Leu321的氨基酸被置換為不同的氨基酸，例如 Ala248Val、Val250Glu、Ser279Asn、Thr316Ile 和 Leu321Phe。在另一個實施方案中，所述 突變選自 SEQ ID N0:8 的 G836A、C743T、A610T、G963T、T749A*C947T。
[0104] 在另一方面，本發明涉及含有內源性突變acs4基因的番茄種子、植物和植物部 分，其中所述非轉基因突變在由acs4基因編碼并由其轉錄并翻譯產生的acs4蛋白中產生 氨基酸的改變，其中所述氨基酸改變選自SEQ ID N0:1的S279N、A248V、L321F、V250E、T316I 及第204至476位氨基酸的完全缺失。
[0105] 在另一方面，本發明涉及與SEQ ID N0:2具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另 一方面，本發明涉及與SEQ ID N0:3具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本發 明涉及與SEQ ID N0:4具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本發明涉及與SEQ ID N0:5具有基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本發明涉及與SEQ ID N0:6具有 基本序列同一性的acs4蛋白。在另一方面，本發明涉及與SEQ ID N0:7具有基本序列同一 性的acs4蛋白。本發明還涉及含有編碼這些蛋白質的核苷酸序列的番茄種子、植物和植物 部分。
[0106] 在另一方面，本發明涉及本發明的植物的番茄果實、種子、花粉、植物部分和/或 后代。優選地，本發明涉及本發明的植物的果實或種子。更優選地，本發明涉及具有延遲的 成熟和/或增加的收獲后貯藏期的番茄果實，所述延遲的成熟和/或增加的收獲后貯藏期 是所描述的至少一個acs4等位基因中的非轉基因突變引起，由本文別處所述。
[0107] 在一方面，本發明番茄植物具有延遲的破色期，意指本發明突變體的第一果實和/ 或所有果實與野生型Acs4/Acs4對照相比需要顯著更多的天數（例如多1、2、3、4、5、6、7、8、 9、10天或更多天）來進入破色期。
[0108] 在另一方面，本發明番茄植物的果實從破色期進入紅熟期需要更多的天數，例如， 本發明植物的果實從破色期進入紅熟期需要的天數比野生型Acs4/A CS4對照多1、2、3、4、 5、6、7、8、9、10、11、12、13 或 14 或更多天。
[0109] 在另一方面，本發明涉及本發明植物的果實，所述果實具有的貯藏期與野生型 Acs4等位基因純和型的番茄果實的貯藏期相比長至少2天。在另一方面，本發明涉及具有 降低的乙烯產生的本發明植物的果實，所述降低的乙烯產生與野生型Acs4等位基因純和 型的番茄相比降低至少15%或降低至少20%。
[0110] 在一個具體的方面，本發明的番茄植株具有與野生型植物的貯藏期相比顯著更長 的貯藏期，例如，當在相同的條件下種植植物且用相同方式處理果實并在相同條件下保存 果實時，從第一果實處于破色期（或轉色期、粉紅期、紅熟期或從收獲時起）直到其開始變 '壞'并不適合出售或食用的天數與對照植物（例如野生型Acs4/A CS4植物）的果實相比顯 著更長，例如，長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多天。
[0111] 延遲的成熟和/或延長的貯藏期可以具有這樣的優勢，即有更多的時間可以用于 將采摘的果實運輸至例如零售商和超市，和/或消費者可以將果實保存更長的時間。可以 在綠熟期或破色期或其后收獲番茄。在破色期之前收獲時，需要乙烯暴露，而在破色期附近 或其后收獲則不需要乙烯接觸，這是由于果實自身產生乙烯。如圖2中所示，本發明的成熟 延遲的突變體在粉紅期和紅熟期與野生型果實相比產生更少的乙烯，但是產生的乙烯足以 使其成熟到紅熟期。在本發明的一個方面，提供了含有編碼功能喪失的acs4蛋白或功能 降低的acs4蛋白的突變acs4等位基因的番茄植物，其中所述植物的果實與野生型（Acs4/ Acs4)植物相比產生明顯更少的乙烯。"明顯更少的乙烯"是指在粉紅期或紅熟期所述果實 產生的乙稀等于或少于純合型Acs4/Acs4果實所產生的乙稀的75%、等于或少于70%、等 于或少于65%、等于或少于60%、等于或少于55%、等于或少于50%、等于或少于45%、等 于或少于40%、等于或少于35%、等于或少于30%、等于或少于25%、等于或少于20%、或 者等于或少于15%。因此，在一方面，在粉紅期產生的乙烯低于約3.5ηV (h · g)，例如等 于或低于約3nl/(h · g)、或等于或低于約2. 5nl/(h · g)、或等于或低于約2. 0nl/(h · g)、 或等于或低于約I. 5nl/(h · g)、或等于或低于約I. 0nl/(h · g)、或等于或低于約0. 5nl/ (h · g)。在一方面，在紅熟期產生的乙稀低于約6nl/(h · g)，例如等于或低于約5. 5nl/ (h · g)、或等于或低于約5. 0nl/(h · g)、或等于或低于約4. 5nl/(h · g)、或等于或低于約 3. 5nl/(h · g)、或等于或低于約3nl/(h · g)、或等于或低于約2. 5nl/(h · g)、或等于或低于 約2. Onl/ (h · g)、或等于或低于約I. 5nl/ (h · g)、或等于或低于約1.0 nl/ (h · g)、或等于或 低于約 0. 5nl/ (h · g)。
[0112] 在另一方面，本發明涉及具有由至少一個acs4等位基因中的非轉基因突變引起 的更長的成熟期和/或增加的收獲后貯藏期的本發明植物的番茄果實，其中所述更長的成 熟期和/或更長的收獲后貯藏期為野生型Acs4等位基因純合型的番茄果實的成熟期和/ 或收獲后貯藏期的至少110%。優選地，所述成熟期和/或收獲后貯藏期為野生型Acs4等 位基因純合型的番茄果實的成熟期和/或收獲后貯藏期的至少115%，更優選至少120%， 甚至更優選至少125%。在另一方面，所述成熟期和/或收獲后貯藏期為野生型Acs4等位 基因純合型的番茄果實的成熟期和/或收獲后貯藏期的至少135%，更優選至少150%，甚 至更優選至少165%。在另一方面，所述成熟期和/或收獲后貯藏期為野生型Acs4等位基 因純合型的番茄果實的成熟期和/或收獲后貯藏期的至少180 %，更優選至少200 %，甚至 更優選至少250%。
[0113] 在本發明的另一方面，提供了具有與本發明番茄植物相同或相似的延遲的成熟 和/或增加的IC藏期的番前植物，所述番前植物的代表性種子由Nunhems B. V.保藏并根 據布達佩斯條約按照Expert Solution(EPC2000, Rule 32(1))于2012年8月21日被接 受保藏在NCMB Ltd.(英國蘇格蘭，阿伯丁郡AB21 9YA，巴克斯本，克萊伯斯通區，弗格 森大廈(Ferguson Building, Craibstone Estate, Bucksburn Aberdeen, Scotland AB21 9 YA，UK))。種子被給予以下保藏號：NCMB 42034(突變體2477)、NCMB 42037(突變體 4043)、NCMB 42038(突變體 4222)、NCMB 42039(突變體 4691)、NCMB 42041(突變體 5251)〇
[0114] 根據另一方面，本發明提供了本發明的番茄植物的細胞培養物或組織培養物。所 述細胞培養物或組織培養物包含可再生細胞。這類細胞可從葉、花粉、胚胎、子葉、下胚軸、 分生細胞、根、根尖部、花藥、花、種子和莖中獲得。
[0115] 還提供了可用于生長出本發明植物的種子，以及含有這類種子的包裝物 (package)。本發明的植物的無性繁殖物也是本文涵蓋的一個方面。同樣的，涵蓋了用于新 鮮食用的或用于加工的或以經加工形式的收獲的果實和果實的部分。可以將果實分級、按 大小分類和/或進行包裝。可以將果實切成片狀或切成塊狀或進一步加工。
[0116] 在另一方面，本發明涉及本發明植物的一個或多個細胞。
[0117] 本發明還涉及整合本發明番茄植物的果實或果實的部分的食品和/或食品產品。 本文使用的食品指被人或動物物種食用的營養物質。實例是三明治、色拉、調味醬（sauce)、 番前醬等。
[0118] 在另一方面，本發明涉及產生本發明番茄植物的方法，所述方法包括以下步驟：
[0119] a.從番茄植物中獲得植物材料；
[0120] b.用誘變劑處理所述植物材料以產生誘變的植物材料；
[0121] c.分析所述誘變的植物材料以鑒定在至少一個和SEQ ID NO: 1或其變體具有基本 序列同一性的acs4等位基因上具有至少一個突變的植物。
[0122] 所述方法還可以包括對所選擇的植物或所述植物的后代的番茄果實的成熟期和/ 或貯藏期進行分析，并選擇其果實具有延遲的成熟和/或延長的貯藏期的植物。
[0123] 在一方面，所述突變可以選自acs4蛋白的大結構域和/或acs4蛋白的第二小結 構域（第339-438位氨基酸）中的突變。在一方面，所述突變選自導致選自以下氨基酸置 換的突變：S279N、A248V、L321F、V250E、T316I，或選自引起SEQIDN0:1的第 204 至 476 位 氨基酸或其一部分的缺失的終止密碼子突變。在另一方面，所述突變選自引起選自以下的 cDNA 改變的突變：SEQ ID N0:8 的 68364、07431\46101\69631\了7494和09471'。在本方法 中，步驟a)的植物材料優選地選自番茄植物株系或栽培種的種子、花粉、植物細胞或植物 組織。更優選植物種子。在另一方面，本方法使用的誘變劑是甲基磺酸乙酯。在步驟b)和 步驟c)中，所述誘變的植物材料優選地是突變群體，例如番茄TILLING群體。
[0124] 因此，在一方面，提供了用于產生具有延遲的果實成熟和/或更長的果實貯藏期 的番茄植物的方法，所述方法包括以下步驟：
[0125] a)提供番茄 TILLING 群，
[0126] b)篩選所述TILLING群的acs4基因上的突變體，特別是編碼大結構域的核苷酸序 列上的突變體，和
[0127] c)從b)的突變植物中選擇出其果實與野生型（Acs4/ACS4)果實相比具有降低的 乙烯產生和/或延遲的成熟和/或更長的貯藏期的那些植物（或那些植物的后代）。
[0128] 優選地將突變植物（Ml)自交一次或多次以產生用于表型分析的例如M2群或優選 M3或M4群。在M2群中，所述突變等位基因以1(突變等位基因純合型）：2(突變等位基因 雜合型）：1(野生型等位基因純合型）的比例存在。
[0129] 在另一方面，本發明涉及用于產生雜交番茄植物的方法，所述方法包括：
[0130] (a)獲得本發明的第一番茄植物和
[0131] (b)用第二番前植物與所述第一番前植物雜交；
[0132] 其中所述雜交番茄植物包含具有一個或多個突變的acs4等位基因。其中所述突 變導致產生與野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能喪失或活性降低的突變acs4蛋白。
[0133] 本發明的植物和植物部分（例如果實、細胞等）可以是所述突變acs4等位基因純 合型或雜合型的。
[0134] 優選地，包含一個或多個突變acs4等位基因（或變體）并且產生與野生型Acs4 蛋白相比acs4蛋白功能喪失或活性降低的突變acs4蛋白的本發明植物不會產生與野生型 植物相比更少的果實。因此，優選地，每個植株的果實數目不減少。
[0135] 可通過計算機（in silico)來鑒定其他推定的ACS4基因/蛋白質，例如通過在已 有的核酸或蛋白質數據庫（例如GENBANK、SWISSPROT、TrEMBL)中使用標準的序列分析軟 件（例如序列相似性搜索工具（BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLAST、FASTA等））來鑒定核酸 或蛋白質序列。
[0136] 在一個實施方案中，提供了 acs4蛋白功能喪失或功能降低的突變Acs4蛋白（包 括變體或直系同源物，例如野生番茄近緣種的acs4蛋白）以及在其基因組中含有一個或多 個acs4等位基因的植物或植物部分，所述acs4等位基因編碼acs4蛋白功能喪失或功能降 低的突變體，由此所述降低的功能賦予了與野生型Acs4等位基因純合型的番茄相比降低 的乙烯產生和/或更慢的果實成熟和/或更長的貯藏期。
[0137] 任何類型的突變都可能導致所編碼Acs4蛋白的功能降低，例如在包含所述 cDNA(SEQ ID N0:8或其變體）的所述基因組DNA中一個或多個核苷酸的插入、缺失和/或 置換。在一個優選的實施方案中，提供了與野生型Acs4等位基因純合型的番茄相比，能夠 減少乙烯產生和/或賦予更慢的果實成熟和/或更長的貯藏期的acs4核苷酸序列，藉此由 于在大結構域中的一個或多個突變而使所述核酸序列編碼功能喪失的acs4蛋白或功能降 低的Acs4蛋白。
[0138] 如本文所描述，可以通過確定該突變等位基因對乙烯產生和/或成熟期和/或貯 藏期的影響來檢測這類蛋白在體內的acs4蛋白功能喪失或功能降低。如本領域已知的，可 以例如使用例如誘變來產生并通過TILLING來鑒定或使用EcoTILLING來鑒定這樣的植物， 即其包含編碼此類突變的功能喪失的acs4蛋白或功能降低的蛋白的核酸序列并且具有與 野生型Acs4等位基因純合型的番茄相比降低的乙烯產生和/或更慢的果實成熟和/或更 長的貯藏期。還可以使用轉基因方法來檢測編碼突變acs4蛋白的突變acs4等位基因的體 內功能性。可以將突變等位基因與植物啟動子可操作地連接，并可以通過轉化將所得嵌合 基因引入番茄植物中。可以檢測再生植物（或后代，例如通過自交獲得的后代）的乙烯產 生和/或果實成熟期和/或貯藏期。例如可以轉化包含無功能的acs4等位基因的番茄植 物以檢測所述轉基因 acs4等位基因的功能性。
[0139] TILLING(定向誘導基因組局部損傷）是一種常用的反向遺傳技術，該技術使用常 規的化學誘變方法產生誘變個體文庫，然后對所述誘變個體文庫進行高通量篩選以發現突 變。TILLING將化學誘變與對混合的PCR產物的突變篩選相結合，導致對靶基因的錯義和無 義突變等位基因的分離。因此，TILLING使用常規的化學誘變（例如EMS或MNU誘變）或 其他誘變方法（例如輻射，如UV)，隨后高通量篩選特定靶基因（例如本發明Acs4)中的突 變。使用Sl核酸酶（例如CELl或END01)切割突變體和野生型靶DNA的異源雙鏈體并使 用例如電泳（如LI-COR凝膠分析儀系統）檢測切割產物，參見例如Henikoff et al. Plant Physiology 2004,135:630-636。TILLING已經應用于很多植物物種，例如番茄（參見
[0140] http: //tilling, ucdavis. edu/index. php/Tomato Tilling)、 稻(Till et al.2007，BMC Plant Biol 7:19)、擬南芥（Till et al. 2006,Methods Mol Biol 323:127-35)、蕓苔、玉米（Till et al. 2004, BMC Plant Biol 4:12)等。
[0141] EcoTILLING也被廣泛使用，由此檢測天然群中的突變體，參見Till et al. 2006(Nat Protoc 1:2465-77)和 Comai et al. 2004 (Plant J 37:778-86)。
[0142] 在本發明的一個實施