在acs4基因中具有非轉基因改變的番茄植物的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及植物生物技術和植物育種的領域。提供了包含具有一個或多個突變的 acs4等位基因的番前（Solanum Iycopersicum)植物，所述突變導致產生與野生型Acs4蛋 白相比acs4蛋白功能喪失的或活性降低的突變acs4蛋白。本發明提供了植物，與野生型 Acs4等位基因純合型的番茄相比，所述植物的果實顯示出更低的乙烯產生和/或更慢的果 實成熟和/或更長的貯藏期。此外，本發明提供了本發明的番茄植物的番茄果實、種子、花 粉、植物部分和后代。本發明還提供了包含本發明植物果實或由其組成的食品和食品產品。
[0002] 本發明還提供了內源性acs4基因和由所述基因編碼的acs4蛋白，具有至少一個 人工誘導的非轉基因突變。
[0003] 在另一個實施方案中，本文提供了用來制備在其基因組中包含一個或多個突變 acs4等位基因的番茄植物的方法。
【背景技術】
[0004] 番茄的育種的目的在于產生被最佳地改造為適于生長和貯藏條件的商業品種。育 種者面臨的挑戰是在收獲后的果實硬度與消費者對味道、質感和顏色的需求之間尋找一種 改進的平衡。這些消費者需求與果實成熟密切相關。果實成熟是一個復雜的發育過程，其負 責將含種子的器官轉化成能吸引種子傳播者（seed dispenser)和農業消費者的組織。與 果實成熟相關的改變（特別是收獲后軟化）限制了新鮮番茄的貯藏期。
[0005] 對于番茄果實的生長和發育，可以識別出許多連續的階段：花發育，授粉，接著發 生特征為高頻率的細胞分裂的早期果實發育，而且所述果實的大小快速增大，這主要是由 于細胞擴增。在第三階段結束時，果實達到綠熟期。在第四階段期間，發生果實成熟，其以 顏色和味道以及果實硬度和質感的變化來表征。
[0006] 番茄紅素和胡蘿卜素的累積致使形成番茄果實的特征性紅色。一般而言，可區 分不同的著色階段：綠熟期（mature green)、破色期（breaker)、粉紅期（pink)和紅熟期 (red)。在破色期階段，開始了典型的紅色色素沉積。紅熟階段或紅熟收獲果實階段是果實 在其主要部分上都達到其成熟顏色的階段。
[0007] 除了所述顏色改變，在果實成熟過程中，酶活性導致細胞壁的中間層狀區域發生 降解，該降解導致表現為果實軟化和果實質感喪失的細胞松弛。通常，果實軟化的測量方式 為對壓縮的外部抵抗力，這可以通過例如果實硬度計（penetrometer)進行量化。
[0008] 對已知參與成熟的單個基因的修飾還沒有獲得正常成熟但具有最小的組織軟化 的果實。
[0009] 乙烯促進呼吸躍變型果實例如番茄的成熟和衰老。乙烯通過增加1-氨基環丙 烷-1-羧酸（ACC)合酶（ACS)和ACC氧化酶（ACO)而自我催化其自身的生物合成。ACS也 稱作1-氨基環丙烷-1-羧酸合酶；Le-ACS ;或S-腺苷基-L-甲硫氨酸甲基硫代腺苷-裂 解酶。因此，ACS和ACO的數量增加導致L-甲硫氨酸到乙烯的轉化增加。在番茄中已經鑒 定了至少八種 ACS 基因（LEACS1A、LEACS1B 和 LEACS2-7) (Alexander et. al.，Journal of Experimental Botany，Vol 53，No 377, pp2039-2055, 2002)，并且各種 ACS 具有不同的表達 方式。
[0010] ACC合酶（ACS)是催化從S-腺苷基甲硫氨酸合成1-氨基環丙烷-1-羧酸（ACC) 的酶。然后ACO催化ACC轉化為乙稀。例如Stearns和Glick(Biotechnology Advances 2003, vol 21pp 193-210)描述了乙烯的生物合成，其以引用的方式納入本文。
[0011] ACS屬于5' -磷酸吡哆醛（PLP)依賴酶的α-家族，并且與該家族的其他成員 (如天冬氨酸氨基轉移酶（AATase)和酪氨酸氨基轉移酶（TATase))具有適度水平的相 似性。Capitani等人已經描述了來自不同來源的ACS的結構。在對八種ACS蛋白（蘋 果（Malus domestica)、綠豆（Phaseolus aureus)、馬鈴薯（Solanum tuberosum)、天竺 葵（Pelargonium hortorum)、煙草（Nicotiana tabacum)、甜瓜(Cucumis melo)、番前 (Lycopersicon esculentum)和甘藍（Brassica oleracea))的序列比對中，他們描述了 在所述Capitani的出版物的圖1中以紅色和黃色指示的保守區。定義了三個結構域： 第52-318位殘基的一個大結構域，以及第20-49位和第333-430位殘基的兩個小結構 域。定義了連接所述大結構域和第二小結構域的螺旋α 12 (Capitani et al·，Journal of Molecular Biology, 1999, vol 294,pp 745-756)〇
[0012] 已經提出了在呼吸躍變型植物調節乙烯產生中起作用的兩個系統。第一個在正 常的營養生長中起作用（系統1);它是自我抑制的并且負責產生基礎乙烯水平，所述基礎 乙烯水平在所有組織（包括非呼吸躍變型植物的那些組織）內都可以檢測到。系統1在 果實發育中繼續直到獲得達到果實成熟的能力。然后到達過渡期，在此期間，LEACS1A和 LEACS4被激活，導致乙烯水平升高。乙烯水平的升高誘導LEACS2的表達，所述LEACS2啟 動在呼吸躍變型果實的成熟過程中發揮作用的系統2。在系統2中，乙烯的產生是自我催 化的。已經在轉基因植物中使用LEACS2的反義抑制來研宄乙烯調節的這種復雜性（Barry et al.，Plant Physiology vol 123, pp 979-986, 2000)〇
[0013] W02005/016504公開了 "保綠"植物，即與標準對照相比其葉片衰老延緩的植物表 型。其公開了具有中斷的ACS2、ACS6、ASC7基因的植物，所述中斷抑制了所述ACS的表達或 活性。
[0014] Yokotani等人描述了所有已知LeEIL基因（乙稀不敏感類基因 （Ethylene Insensitive Like gene))均被抑制的轉基因番前以研宄乙稀生物合成的調節機制 (Yokotani et al, Journal of Experimental Botany, vol 60,pp 3433-3442, 2009)〇
[0015] 因此，需要具有改良的乙烯產生的栽培番茄植物，與野生型番茄植物相比，其番茄 果實的成熟延緩和/或貯藏期更長。
【發明內容】
[0016] 因此，本發明的目的是產生并鑒定番茄種的栽培植物，所述栽培植物的果實具有 延遲的成熟和/或更長的果實貯藏期。
[0017] 因此，本發明涉及包含具有一個或多個突變的acs4等位基因的番茄種的栽培植 物，所述突變導致產生與野生型Acs4蛋白相比acs4蛋白功能喪失或活性降低的突變acs4 蛋白，但是當所述突變等位基因以雜合或純合形式存在時，所述突變acs4蛋白具有足夠的 功能以使番茄果實成熟到紅熟期。
[0018] 一般性定義
[0019] 術語"核酸序列"（或核酸分子）是指單鏈或雙鏈形式的DNA或RNA分子，尤其是 編碼本發明的蛋白質或蛋白質片段的DNA。"分離的核酸序列"是指這樣的核酸序列，即其 不再處于分離出其的天然環境中，例如，在細菌宿主細胞中或者在植物細胞核或質體基因 組中的核酸序列。
[0020] 術語"蛋白質"或"多肽"可互換使用并且指的是由氨基酸鏈組成的分子，不管具體 的作用模式、大小、三維結構或來源。因此，Acs4蛋白的"片段"或"部分"仍可以稱作"蛋 白質"。"分離的蛋白質"用于指不再處于其天然環境中的蛋白質，例如在體外或者在重組的 細菌或植物宿主細胞中。
[0021] 術語"基因"指DNA序列，其包含與適合的調節區（例如啟動子）可操作地連接的 區域（轉錄區），所述區域（轉錄區）在細胞中被轉錄為RNA分子（例如mRNA或RNAi分 子）。因此，基因可以包含若干個可操作地連接的序列，例如啟動子、含有例如參與翻譯起始 的序列的5'前導序列、（蛋白質）編碼區（cDNA或基因組DNA)和含有例如轉錄終止位點 的3'非翻譯序列。基因可以是內源基因（在來源的物種中）或是嵌合基因（例如轉基因 或同源轉基因（cis-gene))。
[0022] "基因的表達"指與適合的調節區（特別是啟動子）可操作地連接的DNA區域轉錄 為RNA的過程，所述RNA具有生物活性，即其能夠被翻譯為有生物活性的蛋白質或肽（或活 性肽片段）或其本身具有活性（例如，在轉錄后基因沉默或RNAi中具有活性）。編碼序列 可以是有義方向的并編碼所需的、有生物活性的蛋白質或多肽、或活性肽片段。
[0023] "活性蛋白質"或"功能性蛋白質"是具有在體外（例如通過體外活性測定）和/ 或在體內（例如通過所述蛋白質賦予的表型）可測量的蛋白質活性的蛋白質。"野生型"蛋 白質是存在于野生型植物中的完全功能性蛋白質。本文的"突變蛋白質"是在編碼該蛋白 質的核酸序列中包含一個或多個突變的蛋白質，其中所述突變導致（所述突變核酸分子編 碼的）"功能降低"或"功能喪失"的蛋白質，例如在體內可測量的（例如通過所述突變等 位基因賦予的表型可測量的）。
[0024] "功能降低的acs4蛋白"或"活性降低的acs4蛋白"是指突變acs4蛋白，與野生 型Acs4蛋白相比，其具有降低的催化由S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，從而導致 乙烯合成減少。當編碼所述突變蛋白的等位基因以純合或雜合形式存在于番茄植物中時， 所述acs4蛋白的催化活性的降低影響了包含這類功能降低的acs4蛋白的果實的成熟行 為，即果實的成熟延遲或貯存期更長。這種功能降低的acs4蛋白可以通過"部分敲除突變 acs4等位基因"（例如，在其核酸序列中包含一個或多個突變的野生型Acs4等位基因）的 轉錄和翻譯來獲得。在一個方面，這種部分敲除突變acs4等位基因是包含一個或多個突變 的野生型Acs4等位基因，所述突變優選地導致產生其中至少一個保守的和/或功能性的氨 基酸被另一個氨基酸置換以使得生物活性顯著降低但不完全消失的asc4蛋白。但是，番茄 Acs4等位基因中的其他突變（例如一個或多個無義、錯義、剪接位點或移碼突變）也可以 導致功能降低的acs4蛋白，并且這種功能降低的蛋白與野生型ACS4蛋白相比，可以有一個 或多個氨基酸被替換、插入或缺失。這種部分敲除突變acs4等位基因也可以編碼顯性負性 的acs4蛋白，該蛋白能夠對同一細胞內的其他Acs4蛋白的生物活性產生不利影響。這種 顯性負性的acs4蛋白可以是這樣的acs4蛋白：其仍然能夠如野生型Acs4蛋白一樣與相 同的元件相互作用但是阻斷了其功能的一些方面。顯性負性的acs4蛋白的實例是這樣的 acs4蛋白：其缺少對于激活的關鍵的特定氨基酸殘基缺失，或在所述特定的氨基酸殘基中 具有修飾，但是仍然包含其結合結構域，使得不僅其自身的生物活性降低或消失，而且它們 還通過與存在于細胞中的野生型和/或部分敲除acs4蛋白競爭結合位點從而降低細胞內 的總acs4活性。突變等位基因可以是"天然突變"等位基因（其是天然存在的突變等位基 因，例如，沒有人工應用誘變劑的情況下而自發產生的）或"誘導突變"等位基因（其是由 人工干擾誘導的，例如，通過誘變）。
[0025] "功能喪失的acs4蛋白"指突變acs4蛋白，其與野生型Acs4蛋白相比基本上沒有 催化從S-腺苷甲硫氨酸合成ACC的催化活性，致使與野生型Acs4蛋白相比乙烯合成減少。 當編碼所述突變蛋白的等位基因以純合或雜合的形式存在于番茄植物中時，所述缺失催化 活性的合成影響了包含這種功能喪失的acs4蛋白的果實的成熟行為。這種"功能喪失的 acs4蛋白"的純合型番茄植物的果實仍可以產生由其他蛋白（例如其他Acs蛋白如AcslA) 催化的乙烯。因此，這種"功能喪失的acs4蛋白"的純合型番茄植物的果實仍可以成熟，但 是成熟可能延遲和/或貯存期可能更長。
[0026] 編碼蛋白質的核酸分子中的"突變"是與野生型序列相比一個或多個核苷酸的改 變，例如通過一個或多個核苷酸的置換、缺失或插入。"點突變"是單個核苷酸的置換，或單 個核苷酸的插入或缺失。
[0027] "無義"突變是編碼蛋白質的核酸序列中的（點）突變，由此一個密碼子變為終止 密碼子。這導致在mRNA中存在提前終止密碼子并導致截短的蛋白。截短的蛋白可能具有 降低的功能或喪失功能。
[0028] "錯義"或非同義突變是編碼蛋白質的核酸序列中的（點）突變，由此一個密碼子 變為編碼不同氨基酸的密碼子。所產生的蛋白質可能具有降低的功能或喪失功能。
[0029] "剪接位點"突變是編碼蛋白質的核酸序列中的突變，由此前mRNA(pre-mRNA)的 RNA剪接發生改變，產生了具有與野生型不同的核苷酸序列的mRNA和具有與野生型不同的 氨基酸序列的蛋白質。所產生的蛋白質可能具有降低的功能或喪失功能。
[0030] "移碼"突變是編碼蛋白質的核酸序列中的突變，由此mRNA的讀碼框發生改變，產 生不同的氨基酸序列。所產生的蛋白質可能具有降低的功能或喪失功能。
[0031] 調節序列（例如基因的啟動子）中的突變是例如通過一個或多個核苷酸的置換、 缺失或插入造成的與野生型序列相比的一個或多個核苷酸的改變，從而導致例如產生減少 的或不產生所述基因的mRNA轉錄產物。
[0032] "沉默"指下調或完全抑制靶基因或基因家族的基因表達。
[0033] 基因沉默方法中的"靶基因"是這樣的基因或基因家族（或基因的一個或多個具 體等位基因）：當嵌合沉默基因（或"嵌合RNAi基因"）被表達并且例如產生沉默RNA轉錄 產物（例如能夠沉默內源靶基因表達的dsRNA或發夾RNA)時，其內源性基因表達被下調或 完全抑制（沉默）。在誘變方法中，靶基因是待突變的內源基因，導致基因表達的改變（降 低或喪失）或所編碼的蛋白質的功能的改變（降低或喪失）。
[0034] 本文使用的術語"可操作地連接"指處于功能性關系中的多核苷酸元件的連接。當 一種核酸與另一核酸序列置于功能性關系中時，該核酸被"可操作地連接"。例如，如果啟動 子（或者更確切地說是轉錄調控序列）影響編碼序列的轉錄，則該啟動子與所述編碼序列 可操作地連接。可操作地連接意指所連接的DNA序列通常是相鄰，并且當需要連接兩種蛋 白質編碼區時所連接的DNA序列是鄰近的且處于讀碼框中以產生"嵌合蛋白"。"嵌合蛋白" 或"雜合蛋白"是由不同的蛋白"結構域"（或基序）組成的蛋白質，所述蛋白本身不是天然 存在的，但是連接后形成了顯示出被連接的結構域的功能的功能性蛋白。嵌合蛋白也可以 是兩個或更多個天然存在的蛋白的融合蛋白。
[0035] 術語"食品"是被消耗以給機體提供營養支持的任何物質。其通常是植物或動物 來源的，并且包含必需營養物質（例如碳水化合物、脂肪、蛋白質、維生素或礦物質）。所述 物質被生物體攝取并被生物體的細胞吸收以努力產生能量、維持生命或刺激生長。術語食 品包括被消耗以給人類和動物機體提供營養支持的物質。
[0036] 術語"貯藏期"或"收獲后貯藏期"是指在果實被認為不適合出售或食用（'壞的'） 之前給予果實的（平均）時間長度。貯藏期是產品能被儲存的時間段，在該時期內所定義的 具體比例貨物的質量在預期的分配、儲藏和展示的條件下仍然是可接受的。貯藏期受以下 幾個因素的影響：光和熱的暴露、氣體的傳送（包括濕度）、機械應力和例如微生物的事物 的污染。通常圍繞所述果實的硬度/柔軟度參數對產品質量進行數學建模。可將貯藏期定 義為植物株系的果實開始變壞并且不適合出售或食用時所花費的（平均）時間，例如從植 物的第一果實進入破色期或轉色期（turning stage)開始或從第一果實完全變紅開始或從 收獲時開始。在一個實施方案中，本發明的突變體具有比野生型植物的貯藏期顯著更長的 貯藏期，例如，當植物在相同的條件下生長并且果實被用相同的方式處理且在相同的條件 下保存時，從第一果實處于破色期（或轉色期、粉紅期、紅熟期或從收獲時起）直到所述第 一果實開始變'壞'并且不適合出售或食用的天數是明顯更長的，例如，比對照植物（例如 野生型Acs4/Acs4植物）的果實的貯藏期長至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天。因 此，為了確定從特定階段（例如從破色期或其后期階段）到變'壞'階段所需要的天數，例 如，可以將野生型對照植物（在與突變體植物相同的條件下生長的并且處于相同的發育階 段）的第一果實進入特定階段（例如，