K. H. Kang, Y. S.Jang,M.S.Yang, Enhanced expression of B-subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in tobacco by optimization of coding sequence, Applied biochemistry and biotechnology, 2004, 117:175-187 ；T. J. Kang, S. C. Han, M. S. Yang, Y. S. Jang, Expression of synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of Escherichia coli heat-labile enterotoxin in tobacco plants, Protein Expr Purif, 2006,46:16-22)為對象及 M. Oszvald 等以大米（M. Oszvald, T. J. Kang, S. Tomoskozi, C. Tamas, L. Tamas, T. G. Kim, Μ· S. Yang, Expression of a synthetic neutralizing epitope of porcine epidemic diarrhea virus fused with synthetic B subunit of Escherichia coli heat labile enterotoxin in rice endosperm, Mol Biotechnol,2007, 35:215-223)以及 Nguyen-Xuan Huy 等（Nguyen-Xuan Huy, Moon-Sik Yang. Expression of a Cholera Toxin B Subunit-Neutralizing Epitope of the Porcine Epidemic Diarrhea Virus Fusion Gene in Transgenic Lettuce.Mol Biotechnol. 2011,48:201 - 209)利用萬苣為對象研發 轉基因植物疫苗。但將TGEV和PEDV保護性抗原片段串聯研發轉基因植物疫苗尚未見報道， 且煙草、大米胚乳和萵苣等這些作物均不適合在豬飼料中大量添加。玉米作為豬飼料的重 要來源，具有不可替代的優勢。
【發明內容】
[0008] 針對現有技術的不足，本發明的目的之一在于提供一種含TGEV及PEDV保護性抗 原的融合基因。
[0009] 本發明的第二目的在于提供一種編碼上述融合基因的蛋白。
[0010] 本發明的第三個目的在于提供一種包含上述融合基因的重組表達載體。
[0011] 本發明的第四個目的在于提供一種上述融合基因在制備轉基因植物疫苗方面的 應用。
[0012] 為了實現上述目的，本發明采用了以下的技術方案：
[0013] 一種含TGEV及PEDV保護性抗原的融合基因（即串聯基因），名稱為sTP，其堿基 序列如序列表SEQ ID NO. 1所示。
[0014] 一種編碼上述融合基因的蛋白，其氨基酸序列如序列表SEQ ID NO. 2所示。
[0015] 一種包含上述融合基因的重組表達載體，優選地，在所述重組表達載體中，由胚乳 特異性Zein啟動子驅動所述融合基因 sTP的表達，更優選地，在所述重組表達載體中，以編 碼除草劑草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作為選擇標記。更優選地，所述重組表達載體為如 圖2所示的pBAC9090。
[0016] -種上述融合基因在制備轉基因植物疫苗方面的應用。
[0017] 優選地，所述應用的具體方法如下：將所述融合基因 sTP導入植物中，通過鑒定、 篩選得到可穩定表達所述融合基因 sTP的轉基因植物疫苗。所述植物優選為玉米。
[0018] 在所述應用中，所述融合基因 sTP優選是通過插入植物表達載體而得到的重組表 達載體導入玉米中的。
[0019] 在所述應用中，所述含有融合基因 sTP的重組表達載體可通過基因槍法、使用Ti 質粒、Ri質粒、植物病毒載體、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化到玉米的 細胞或組織中。
[0020] 在所述應用中，所述植物表達載體可以是基因槍轉化用常規載體。
[0021] 在所述應用中，所述重組表達載體優選以胚乳特異性Zein啟動子驅動目的基因 sTP的表達，更優選地，以編碼除草劑草甘膦抗性的CP4型EPSP基因作為選擇標記。
[0022] 在所述應用中，優選地，所述融合基因 sTP通過重組表達載體pBAC9090導入玉米 中，所述重組表達載體PBAC9090如圖2所示。更優選地，所述重組表達載體pBAC9090通過 基因槍法導入玉米中。
[0023] 所述玉米材料優選為易于遺傳轉化的玉米自交系501。
[0024] 本發明優選以玉米為生物反應器，將豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV)及豬流行性腹 瀉病毒（PEDV)保護性抗原位點的串聯基因 sTP導入玉米自交系，從而獲得含TGEV及PEDV 保護性抗原轉基因玉米疫苗。首先，根據玉米密碼子的偏好性，設計合成優化的TGEV-PEDV 串聯編碼基因 sTP，構建了含有人工合成的sTP基因的表達載體pBAC9090,其以胚乳特異 性Zein啟動子驅動目的基因 sTP的表達。然后，以玉米自交系501作為受體材料，利用 roSlOOO/He基因槍轉化玉米自交系501的幼胚，經過愈傷組織誘導、分化再生培養，獲得22 株轉化再生植株，進而通過田間草甘膦抗性篩選，獲得4個轉基因玉米株系。利用PCR方法， 對獲得的4個轉基因玉米株系進行檢測分析，其中3株均成功檢測到轉基因目的片段，表明 sTP基因已成功整合到玉米基因組中。然后利用間接ELISA和Western blot等方法，對獲 得的4個轉基因玉米株系進行檢測分析，結果顯示部分植株的sTP基因已成功整合到玉米 基因組并進行了蛋白表達。通過對轉基因玉米株系的種子中的目的蛋白含量的定量分析得 出目的蛋白在種子中的表達量較高。經以下實驗證明表達產物具有顯著的免疫原性：提取 轉基因玉米穩定株系的可溶性蛋白，與佐劑混合皮下注射免疫小鼠，結果表明經免疫的小 鼠可產生針對TGEV及PEDV抗原的特異性抗體。另外，動物實驗證明，本發明得到的轉基因 玉米疫苗同時具有免疫TGEV及PEDV病毒的功效。因此本研宄獲得的轉基因玉米可穩定表 達sTP蛋白，表達產物具有顯著的免疫原性。
【附圖說明】
[0025] 圖1是本發明融合基因 sTP的結構示意圖；
[0026] 圖2是本發明構建的重組表達載體pBAC9090的示意圖；
[0027] 圖3是Tl代轉基因玉米株系基因組中sTP基因的PCR檢測結果，其中：M :分子量 標準；I :T1代株系I ;2 :T1代株系2 ;3 :T1代株系3 ;4 :T1代株系4 ;5 :陰性對照；6 :陽性 對照；
[0028] 圖4是Western blot檢測轉基因玉米株系總蛋白中sTP的表達情況，其中:分 子量標準；1 :非轉基因植株；2 :未上樣孔；3 :T1代株系I ;4 :T1代株系2 ;5 :T1代株系3 ; 6 :T1代株系4 ;
[0029] 圖5是轉基因玉米中sTP蛋白免疫小鼠后針對TGEV CB抗原位點血清抗體的 ELISA檢測結果；
[0030] 圖6是轉基因玉米中STP蛋白免疫小鼠后針對PEDV COE抗原位點血清抗體的 ELISA檢測結果。
【具體實施方式】
[0031] 下面通過具體實施例對本發明的含TGEV及PEDV保護性抗原的融合基因及其編碼 蛋白和應用進行詳細說明，但本發明并不限于此。應理解，這些實施例僅用于說明本發明而 不用于限制本發明的范圍。下面實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常為本領域常規 方法，如按照常規實驗條件如Sambrook等人，分子克隆，實驗手冊（第三版）（科學出版社， 2002)中所述的條件，或按照試劑制造廠家所建議的條件。
[0032] 以下實施例中涉及的PCR反應用試劑、限制性內切酶和抗生素購自大連寶生物公 司；大腸桿菌DH5a、各種規格的分子量標準、質粒提取試劑盒和瓊脂糖凝膠DNA回收試劑 盒、增強型HRP-DAB底物顯色試劑盒等購自天根生化公司。
[0033] 實施例1使用的大腸桿菌表達并純化的TGEV CB抗原位點和PEDV COE抗原位點 標簽蛋白的制備方法
[0034] (1)首先在NCBI網站的GenBank中獲得TGEV和PEDV的cDNA序列，編碼分別為 GenBank accession No. AJ271965. 2和No. JN825712. 1，其中S編碼基因的堿基序列分別位 于 20365-24708 (TGEV，共 4344bp)和 20634-24794 (PEDV，共 4161bp);選擇 TGEV 中 S 編碼 基因中118-510(包含CB抗原位點）和PEDV中S編碼基因中1363-1968(包含COE抗原 位點）片段克隆入原核表達載體pET_32a (購自Novagen公司），經酶切和測序鑒定，將陽 性質粒（pET-32a-CB和pET-32a-C0E)分別轉化到表達菌Rosetta(DE3)感受態細胞（購 自康為世紀生物技術有限公司）中用于表達，構建參考周宏專等（周宏專，覃湘婕，楊 兵，等.豬傳染性胃腸炎病毒S基因不同編碼區的表達和反應原性鑒定[J].華北農學 報，2014, 06:63-6