含tgev及pedv保護性抗原的融合基因及其編碼蛋白和應用
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種融合基因、編碼蛋白和應用，具體涉及一種含TGEV及PEDV保護性 抗原的融合基因及其編碼蛋白和應用。
【背景技術】
[0002] 豬傳染性胃腸炎是以嘔吐、嚴重腹瀉、脫水和對2周齡以內仔豬高度致死性 為特征，不同品種和年齡的豬均易感，該病是由豬傳染性胃腸炎病毒（Transmissible Gastroenteritis Virus，TGEV)引起的，其主要危害新生仔豬，隨著日齡的增大，該病的死 亡率逐漸下降，但往往會造成生產性能下降，飼料報酬率降低，經濟損失較大。豬流行性腹 瀉病以腹瀉、嘔吐和脫水為特征，各種年齡和品種的豬群都易感，尤其哺乳仔豬危害最嚴 重，該病是由豬流行性腹瀉病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)引起的，該病 在我國26個省市自治區都有發生，并且近幾年來流行區域有逐漸擴大的趨勢。目前，已成 為我國養豬業重要的腹瀉病之一。
[0003] 目前，臨床上，這兩種病常混合感染，導致臨床癥狀類似的腹瀉病，因此滅活苗等 常提供的是上述兩種病的二聯苗，即使用滅活苗或弱毒苗接種，但滅活苗和弱毒苗的制備 和使用較繁瑣。且滅活苗免疫應答產生較慢，不能激發產生以分泌IgA(SIgA)抗體為主的 粘膜免疫反應，免疫效果不夠理想，成本也很高；而弱毒苗存在易返祖、有潛在感染危險。
[0004] 同屬冠狀病毒屬的上述兩種病毒的S蛋白均在各自的免疫反應中發揮重要作用， 因此許多的研宄中，S基因也成為了這兩種病毒基因工程疫苗研宄的首選抗原基因。
[0005] TGEV保護性抗原位點的研宄主要基于F. Gebauer 等（F·Gebaue;r，W· P. Posthumus, I. Correa, C. Sune, C. Smerdou, C. M. Sanchez, J. A. Lenstra, R. H. Meloen, L. Enjuanes, Residues involved in the antigenic sites of transmissible gastroenteritis coronavirus S glycoprotein, Virology, 1991, 183:225-238)依據單 克隆抗體相互競爭的實驗方法，研宄發現S蛋白存在三種水平的抗原結構，即抗原位點 (Sites)、抗原亞位點（Subsites)和抗原決定簇（Epitopes)。TGEV S抗原分為A，B，C, D共 4個抗原位點。A抗原位點又可分為Aa，Ab和Ac3個亞位點，通過相關實驗，證明這些亞位 點又可再分為抗原決定簇，S蛋白共有11個抗原決定簇，其中5個是與中和作用相關的重 要抗原決定簇。研宄證實，這四個抗原位點都位于S蛋白N端的543個氨基酸殘基之內。
[0006] PEDV保護性抗原位點研宄方面：S. H. Chang等以!1.〇1&叩，1丄.8&6，1'· J.Kang. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus. Mol. Cells, 2002, 14:295 - 299)用大腸桿菌表達I3EDV S基因上499-638蛋白，注射小鼠后產 生的多克隆血清能明顯地抑制PEDV空斑的形成。推測PEDV S蛋白的中和抗原表位主要 位于第498-638之間，基因長度為420bp。隨后，將該片段命名為COE(core neutralizing epitope) 〇D. J. Cruz 等（D. J. Cruz, C. J. Kim, H. J. Shin, Phage-displayed peptides having antigenic similarities with porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) neutralizing 印itopes，Virology, 2006, 354:28-34)利用噬菌體隨機肽庫鑒定了 PEDV S蛋白的一 個模擬表位（1368GPRLQPY1374)。并于2008年證實該片段能夠誘導中和抗體的產生 (D. J. Cruz, C. J. Kim, H. J. Shin, The GPRLQPY motif located at the carboxy-terminal of the spike protein induces antibodies that neutralize Porcine epidemic diarrhea virus, Virus Res, 2008, 132:192-196)。D. Sun Chen, S. Liu, Y. Tong, Y. Wang, G. Tong, Identification of two novel B cell epitopes on porcine epidemic diarrhea virus spike protein, Vet Microbiol, 2008, 131:73-81 ;孫 東波，豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原表位鑒定及受體結合域的初步篩選，中國農業科學院， 2008)利用fd絲狀噬菌體展示系統及生物信息學方法鑒定出PEDV S蛋白5個線性抗原表 位即SlPl (第248~280位氨基酸）、S1P2 (第442~499位氨基酸）、S1P3 (第697~742 位氨基酸）、SS5 (第748~755位氨基酸）和SS6 (第764~771位氨基酸），1個中和表位 區（SID，第636~789位氨基酸），1個豬氨基肽酶N潛在的受體結合域（MRR，第249~529 位氨基酸）。這些抗原表位以及受體結合域的揭示對進一步分析PEDV S蛋白的結構與功能 具有重要的指導意義。
[0007] 近年來，隨著植物基因工程技術的迅速發展，利用轉基因技術構建植物生物反應 器生產疫苗已成為當前植物基因工程研宄的一個重要方向。轉基因植物疫苗有以下優點： 植物細胞具有全能性，能夠再生植株且易于成活；植物細胞完整的真核細胞表達系統使表 達產物具有良好的免疫原性及生物學活性；植物細胞壁的天然生物膠囊作用能避免抗原蛋 白在消化道中被降解，同時又能起到一定的緩釋作用；生產非常簡單，成本低，易于大規模 生產，且便于運輸和保存；使用方便，動物在采食過程中達到免疫的目的，避免了繁瑣的免 疫程序和對動物的應激反應；使用安全，沒有其它病原的污染。因此，對豬安全、有效，并 能迅速產生免疫力的基因工程疫苗將有較好的應用前景。目前作為植物生物反應器研宄 的最多的表達系統是煙草，但煙草含有大量生物堿毒素，下游處理費用較高。玉米作為目 前畜禽飼料最大量的組分，有著產量高、環境適應力強、果實不需高溫加熱等優勢，所以在 畜禽轉基因植物疫苗的研宄中吸引著越來越多研宄者的目光。TGEV方面，有使用轉基因 芥菜(N. Gomez, C. Carrillo, J. Salinas, F. Parra, Μ. V. Borca, J. M. Escribano, Expression of immunogenic glycoprotein S polypeptides from transmissible gastroenteritis coronavirus in transgenic plants, Virology, 1998, 249:352-358)、土豆(N. Gomez, A. ffigdorovitz, S. Castanon, F. Gil, R. Ordas, Μ. V. Borca, J. M. Escribano, Oral immunogenicity of the plant derived spike protein from swine-transmissible gastroenteritis coronavirus，A;rch Virol, 2000, 145:1725-1732)、煙草（T.Tuboly，W· Yu, A. Bailey, S. Degrandis, S. Du, L. Erickson, E. Nagy, Immunogenicity of porcine transmissible gastroenteritis virus spike protein expressed in plants, Vacci ne，2000，18,2023-2028)等表達TGEV S基因相關片段的報道。PEDV方面，J.L.Bae，T. J. Kang 等以煙草（J. L. Bae, J. G. Lee, Τ· J. Kang, Η· S. Jang, Υ· S. Jang, Μ· S. Yang, Induction of antigen-specific systemic and mucosal immune responses by feeding animals transgenic plants expressing the antigen, Vaccine, 2003, 21:4052-4058 ； T. J. Kang, Y. S. Kim, Y. S. Jang, M. S. Yang, Expression of the synthetic neutralizing epitope gene of porcine epidemic diarrhea virus in tobacco plants without nicotine, Vaccine, 2005, 23 : 2294-2297 ；T. J. Kang, S. C. Han, M. 0. Jang,