的制備 將NC08 (制備方法參見中國專利：重組人抗狂犬病毒單克隆抗體的制備方法，公開號 CN101100663A)用0.5 mol/L鹽酸調pH值至3.5,37°C水浴30分鐘。將胃蛋白酶(購自 Sigma-Aldrich Co.公司）與抗體樣品按1:50 (w/w)的比例混合，37°C水浴2小時，加入 0. 5mol/L Na2HPO4溶液調pH值至7. 0終止反應后，離心去除沉淀。
[0042] 用層析介質rProteinA對酶切所得NC08F (ab'）2進行純化后，用30kD超濾膜對所 得純化溶液超濾換液，保存溶液組成為lOmmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH6.0。根據體積加 入1/200體積的10mg/ml Tween80,混勻，用(λ 22 μ m濾膜過濾，分裝。用還原SDS-PAGE電 泳法檢測制備所得抗原NC08F(ab'）2的純度>90% (電泳圖見圖1)。
[0043] 2)免疫小鼠 用步驟1)制得的NC08F(ab'）2皮下注射免疫6周齡Balb/c小鼠，首次免疫使用福氏 完全佐劑，每隔兩周使用福氏不完全佐劑加強免疫一次，共免疫三次，每次每只50 μ g。取上 述免疫的小鼠脾臟，制成淋巴細胞單細胞懸液。
[0044] 3)融合和克隆化 按照 "The Protein Protocols Handbook" 第二版（John Μ· Walker 2002 Humana Press Inc.) "PART VIII MONOCLONAL ANTIBODIES "159 節"Hybridoma Production" 中所述方法，將步驟2)制得的淋巴單細胞與BALB/c小鼠來源的sp2/0骨髓瘤細胞進行 融合及克隆培養。米用《The Protein Protocols Handbook》第二版（John M. Walker 2002 Humana Press Inc.) PART VIII MONOCLONAL ANTIBODIES 第 161 節 Screening Hybridoma Culture Supernatants Using ELISA 所述方法，使用 NC08 對克隆進行篩選，最 后篩選得到一株表達抗NC08鼠源單抗的雜交瘤細胞株10C7。
[0045] 實施例2抗體可變區編碼序列的克隆和測序 1)取實施例1篩選得到的雜交瘤細胞株進行懸浮培養，取細胞IO7個，于4°c以離心力 200g離心5分鐘，盡棄上清，所得細胞使用Qiagen公司的RNA抽提試劑盒（MagAttract RNA Cell Mini M48 Kit)提取總 RNA。
[0046] 2)以提取的RNA為模版，使用TaKaRa公司的RT-PCR試劑盒（RNA PCR Kit (AMV) Ver. 3. 0)進行RT-PCR反應，反轉錄引物分別為： A輕鏈擴增引物： 正向引物： LLl :5' ATGGAGACAGACACACTCCTGCTAT 3' LL2 :5^ ATGGATTTTCAAGTGCAGATTTTCAG 3' LL3 :5' ATGGAGWCACAKWCTCAGGTCTTTRTA 3' LL4 :5 ' ATGKCCCCWRCTCAGYTYCTKGT 3 ' LL5 :5' ATGAAGTTGCCTGTTAGGCTGTTG 3' 反向引物： C κ : 5 ' GTTGGTGCAGCATCAGC 3 ' B重鏈引物： 正向引物： VHl :5' ATGGRATGSAGCTGKGTMATSCTCTT 3' VH2 :5' ATGRACTTCGGGYTGAGCTKGGTTTT 3' VH3 :5' ATGGCTGTCTTGGGGCTGCTCTTCT 3' VH4 ： 5? ATGATRGTGTTRAGTCTTYTGTRCCTG 3? 反向引物： C γ : 5 ' GGGGCCAGTGGATAGAC 3 ' 反應結束后取反應物在1. 5%瓊脂糖凝膠電泳上進行分離，采用Qiagen公司的膠回收 試劑盒（QIAquick Gel Extraction Kit)提純擴增的DNA片段，進行序列測定(交由上海生 工生物工程技術服務有限公司進行測定)。結果如下：SEQ ID N0:3顯示了其輕鏈可變區基 因序列（5,到3'，324bp)，其氨基酸序列顯示在SEQ ID NO: 1中；SEQ ID NO: 4顯示了其 重鏈可變區基因序列（(5'到3'，360bp)，其氨基酸序列顯示在SEQ ID N0:2中。
[0047] 實施例3抗體的表達載體構建、表達與純化 1)用EcoR I和Not I限制性酶酶切表達載體pMH3,然后將上述抗體可變區與鼠源恒 定區通過搭橋PCR拼接起來，并在兩端設計EcoR I和Not I酶切位點序列，之后與酶切的 表達載體連接，從而構建得到分別含有重組抗NCOS抗體輕鏈全長和重鏈全長基因的表達 載體PMH3-L和pMH3-H，如圖2、3所示。
[0048] 2) CHO細胞轉染與克隆篩選 上述構建的表達載體分別轉化大腸桿菌DHlOB菌種，接種于100毫升LB培養基中進行 擴增，收集細胞，用Qiagen公司質粒DNA純化試劑盒（QIAGEN Plasmid Mini Kit)抽提質 粒DNA4 μ g，采用電轉化法將上述質粒轉染CHO細胞，電轉條件：240 V、25 Ω、50 μ F。
[0049] 轉染后的CHO細胞在MTX選擇培養基上進行克隆篩選，最后在96孔板上進行有限 稀釋培養，連續進行3次。挑取單克隆細胞系在RPMI1640培養基中進行培養，用ELISA法 檢測上清中的抗體表達水平，選擇表達水平最高的克隆作為工作株保存。
[0050] 3)抗體純化與檢測 將選定的工作株培養后，收集細胞上清或培養液，l〇〇〇〇rpm、4°C離心20分鐘，經 0. 45 ym濾膜過濾、抽濾除氣后備用。0. lmol/L的PB緩沖液（pH7. 0)作為平衡緩沖液平衡 Protein A Sepharose 4 Fast Flow層析柱，流速Iml/分鐘平衡10-20個柱體積至記錄儀 基線穩定。將處理后的上清以同樣流速上樣，收集流穿液。上樣結束后用平衡緩沖液洗至 基線平穩。用0. lmol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液（pH3. 0)洗脫融合蛋白，流速Iml/分鐘，收 集洗脫峰，用lmol/L的Tris-HCL緩沖液調pH至中性，經超濾濃縮置換于PBS (pH7. 4)緩 沖液中，凍存，用于以下的進一步分析與研宄。
[0051] 實施例4單克隆抗體親和力測定 1)標記NC08 依照偶聯試劑盒（Amine Coupling Kit，購自GE公司）說明，將EDC和NHS按一定的 比例加水分別溶解；CM5傳感片（GE公司）插入檢測儀Biacore 2000 (GE公司）后，控制流 速為 5μ1 / 分鐘，用 HBS 緩沖液（10 mmol/1 HEPES、150 mmol/1 NaCl、3.4 mmol/1 EDTA、 0. 005% Tween20，pH7. 4)平衡體系，待基線穩定，開始標記NC08 : (I)EDC和NHS各100 μ L混 合均勻，注射50 μ 1混合液使其流過待標記通道，活化傳感片表面的羧基；（2)注射3. 0mg/L NC08溶液（溶于10 mmol/1醋酸鈉緩沖液，pH4. 5)，將NC08通過氨基偶聯標記于芯片表面， 標記目標8000RU ; (3)注射35 μ L乙醇胺的鹽酸溶液封閉殘余的活化羧基；(4)注射10 μ 1 甘氨酸緩沖液洗去非鍵合的吸附蛋白和乙醇胺。
[0052] 2)單抗結合過程檢測 用HBS緩沖液梯度稀釋實施例3制備所得單抗（35. 5 μ g/ml、17. 75 μ g/ml、8. 9 μ g/ml、 4. 45 μ g/ml、2. 2 μ g/ml)，12 OOOrpm離心10分鐘，上機檢測。上樣30秒（流速30 μ I/分 鐘)，HBS緩沖液平衡4分鐘（流速30 μ 1/分鐘），lOmmol/1甘氨酸緩沖液（pH2. 0)再生30秒 (流速30 μ 1/分鐘），HBS緩沖液平衡3分鐘。
[0053] 3)親和常數計算 通過BIAeval 3. 0軟件，計算單抗與NC08的結合常數為4. 7nmol/l。
[0054] 實施例5應用單抗檢測NC08的橋聯ELISA法 用包被液緩沖液（〇. I mol/L碳酸鹽，pH 9. 6)稀釋實施例3制備所得單抗至10 μ g/ ml，4 °C過夜包被酶標板，用封閉液（1%BSA-PBS )封閉，將含有不同濃度NC08的標準品 (S1-S5)和含有NC08的血清樣本(將特定量NC08樣品加入人血清中制備所得樣本X1-X3) 及陰性對照品（Blank)加入孔板，37°C孵育90分鐘。用PBS洗板3遍，用封閉液稀釋實施 例3制備所得單抗至10 μ g/ml。加入板孔中，37°C孵育1小時。洗板3遍，加入用封閉液稀 釋的人血清吸附處理的羊抗鼠 IgG-HRP加入板孔中，37°C孵育1小時。
[0055] 用PBS-T洗板5遍，向板孔中加入TMB底物顯色液，37°C顯色30分鐘。加終止液 (2mol/l H2SO4) 5〇μ1/孔，終止反應。終止后30分鐘內讀數，波長450/630nm。根據標準曲 線（標準曲線見圖4 )計算樣品的NC08含量。含量測定結果實例見表1。
[0056] 表1 NC08橋聯ELISA法測定數據實例
【主權項】
1. 一種重組抗NCOS單克隆抗體，它包含重鏈可變區和輕鏈可變區，其特征在于，輕鏈 可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 1所示，重鏈可變區的氨基酸序列如SEQ ID NO: 2所示。
2. -種DNA分子，其特征在于，它編碼權利要求1所述的單克隆抗體。
3. 根據權利要求2所述的DNA分子，其特征在于，該DNA分子含有SEQ ID NO: 3所示的 編碼所述單克隆抗體輕鏈可變區的核苷酸序列，以及SEQ ID N0:4所示的編碼所述單克隆 抗體重鏈可變區的核苷酸序列。
4. 一種表達載體，其特征在于，它含有權利要求2所述的DNA分子。
5. -種真核宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求4所述的表達載體。
6. 根據權利要求5所述的真核宿主細胞，其特征在于，它是CHO細胞。
7. -種制備權利要求1所述的單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包括： a) 構建含有權利要求2所述DNA分子的表達載體； b) 用步驟a)所述的表達載體轉化真核宿主細胞； c) 培養步驟b)所得的真核宿主細胞； d) 分離純化獲得所述單克隆抗體。
8. 權利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測NC08濃度的試劑中的應用。
9. 權利要求1所述的單克隆抗體在制備檢測NC08濃度的試劑盒中的應用。
10. 權利要求1所述的單克隆抗體在檢測NC08免疫原性中的應用。
【專利摘要】本發明提供了一種重組抗NC08單克隆抗體，輕鏈可變區具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本發明還公開了編碼該抗體的DNA分子，表達該抗體的載體以及被該表達載體轉化的真核宿主細胞。本發明提供的抗NC08單克隆抗體能在NC08用藥過程中快速檢測受試者血清中NC08濃度，同時也能作為抗NC08的陽性對照抗體應用于NC08的免疫原性檢測。
【IPC分類】C12N15-13, G01N33-569, C12N15-85, C12N5-10, C07K16-10, C07K1-22
【公開號】CN104804083
【申請號】CN201510204226
【發明人】魏敬雙, 王輝, 陳忱, 張世雄, 江一帆, 呂若蕓, 張斌, 曹佳彬, 吳軍營, 趙宏遠, 王麗, 高健, 段寶玲
【申請人】華北制藥集團新藥研究開發有限責任公司
【公開日】2015年7月29日
【申請日】2015年4月27日