一種鼠源單克隆抗體及其制備方法和用圖
【技術領域】
[0001] 本發明涉及抗體技術領域。具體地說，本發明涉及一種新的重組抗人抗狂犬病毒 單克隆抗體的單克隆抗體，及其制備方法和用途。
【背景技術】
[0002] 狂犬病是由狂犬病毒所致的自然疫源性或動物源性人畜共患急性傳染病，流行性 廣，病死率幾近百分之百，對人民生命健康造成嚴重威脅。人狂犬病主要通過患病動物咬 傷、抓傷或由粘膜感染引起，在特定的條件下還可通過呼吸道氣溶膠傳染。傳染動物主要是 犬（超過90%)，其次是貓。根據中國疫情報告系統資料，1998年后狂犬病疫情年增長幅度 越來越高，死亡人數不斷攀升。
[0003] 對于狂犬病毒暴露后預防，WHO推薦的處理方法是全程注射狂犬疫苗，同時合并注 射抗狂犬病馬血清（ERIG)或抗狂犬病毒人免疫球蛋白（HRIG)。但HRIG由于來源限制價格 昂貴，而馬血清制品則較易發生嚴重的過敏反應，所以現今國際上已經公認有必要用重組 單克隆抗體取代狂犬病毒暴露后預防中使用的抗狂犬病毒血源抗體。
[0004] 此外，抗狂犬病毒重組單克隆抗體具有中和效果好、安全性好、成本低、可大量生 產等優點，具有取代ERIG和HRIG的潛在能力，可用于狂犬病的暴露后預防。陳哲等人運用 噬菌體表面呈現技術，采集多個具有高滴度狂犬病毒抗體的狂犬病毒疫苗注射者外周血淋 巴細胞，構建了抗狂犬病毒Fab基因工程抗體文庫，并對抗體庫進行富集篩選，獲得特異 性抗狂犬病毒基因工程抗體Fab段，并將其命名為RVFab8。由于小分子抗體在親和力和中 和活性方面均低于全抗體，于是他們將上述Fab抗體RVFabS的輕鏈和重鏈基因分別克隆進 入全抗體表達載體Pac-L-Fc并轉染昆蟲Sf9細胞，利用桿狀病毒/昆蟲細胞系統實現全抗 體的分泌型表達得到全抗體RVIgG8。并進一步對其進行功能鑒定，結果表明RVIgG8具有 較好的中和活性，能達到876. 61IU/mg，完全具備了中和國際標準攻擊毒株CVS-Il株的能 力（病毒學報.2010. 7;26(4) :271-275)(中國專利：人源抗狂犬病毒糖蛋白中和性抗體 (RVFab8)，公開號 CN101812131A)。
[0005] 華北制藥集團新藥研宄開發有限責任公司將RVFab8的全抗體基因序列在CHO 細胞表達系統中表達，構建出成功高效表達該抗體的工程細胞，并把得到的單克隆抗體 命名為NC08。該方法操作工藝簡便、產品表達水平高、生產的抗體質量均一性及穩定 性好，具備產業化價值（中國專利：重組人抗狂犬病毒單克隆抗體的制備方法，公開號 CN101100663A)。此外，NC08與本公司之前開發的匪57組成組合制劑，可進一步擴大對狂 犬病毒毒株的覆蓋。
[0006] 在NC08及其組合制劑進行臨床前研宄及臨床研宄的過程中，以及將來成為藥物 后患者應用的過程中，為了研宄藥物代謝及保證用藥安全，需要檢測受試者(動物或人）或 患者血清的NC08濃度或者需要檢測人抗NC08的抗體。在某些情況下，可能需要從現有產 品中檢測有無 NC08的添加。因此，迫切需要一種能有效、快速檢測NC08和人抗NC08抗體 的廣品。
【發明內容】
[0007] 本發明需要解決的第一個技術問題是提供一種抗NCOS單克隆抗體，用于檢測 NC08濃度和人抗NC08抗體。
[0008] 本發明需要解決的第二個技術問題是提供一種編碼上述抗NC08單克隆抗體的 DNA分子。
[0009] 本發明需要解決的第三個技術問題是提供一種表達載體。
[0010] 本發明需要解決的第四個技術問題是提供一種真核宿主細胞。
[0011] 本發明需要解決的第五個技術問題是提供一種該重組抗NC08單克隆抗體的制備 方法。
[0012] 本發明需要解決的第六個技術問題是提供上述單克隆抗體的兩種用途。
[0013] 為實現上述發明目的，本發明一方面提供了一種重組抗NC08單克隆抗體，該抗體 含有重鏈可變區和輕鏈可變區，其特征在于，輕鏈可變區具有SEQID NO: 1所示的氨基酸序 列，重鏈可變區具有SEQ ID N0:2所示的氨基酸序列。
[0014] 本發明另一方面提供了編碼上述單克隆抗體的DNA分子。
[0015] 在一個較佳的實例中，該DNA分子含有SEQ ID NO:3所示的編碼所述單抗輕鏈可 變區的核苷酸序列，以及SEQ ID N0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區的核苷酸序列。
[0016] 本發明第三方面提供了一種表達載體，該表達載體含有上述DNA分子。
[0017] 本發明第四方面提供了一種宿主細胞，其特征在于，它含有上述表達載體。在一個 較佳的實例中，該宿主細胞是CHO細胞。
[0018] 本發明第五方面提供了一種制備上述單克隆抗體的方法，其特征在于，該方法包 括： a) 構建含有權利要求2所述DNA分子的表達載體； b) 用步驟a)所述的表達載體轉化宿主細胞； c) 培養步驟b)所得的宿主細胞； d) 分離純化獲得所述單克隆抗體。
[0019] 本發明提供的抗體可以在體外檢測NC08的濃度和人抗NC08抗體，本發明第六方 面提供了一種利用本發明所述抗體檢測NC08濃度的方法。在一個較佳的實例中，檢測方法 為橋聯ELISA法。該抗體可用于制備檢測試劑或者檢測試劑盒。
[0020] 本發明涉及一種重組抗NC08單克隆抗體，該抗體包含重鏈可變區和輕鏈可變區， 輕鏈可變區具有SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列，重鏈可變區具有SEQ ID NO:2所示的氨 基酸序列。
[0021] 本文所用的術語"單克隆抗體(單抗)"指從一類基本均一的群體獲得的抗體，即該 群體中包含的單個抗體是相同的，除少數可能存在的天然發生的突變外。單克隆抗體高特 異性地針對單個抗原位點，而且，與常規多克隆抗體制劑(通常是具有針對不同決定簇的不 同抗體）不同，各單克隆抗體是針對抗原上的單個決定簇。除了它們的特異性外，單克隆抗 體的好處還在于它們是通過基因工程手段合成的，不會被其它免疫球蛋白污染。修飾語"單 克隆"表示了抗體的特性，是從基本均一的抗體群中獲得的，這不應被解釋成需要用任何特 殊方法來生產抗體。
[0022] 本文所用的術語"抗體"和"免疫球蛋白"是有相同結構特征的約150000道爾頓 的異四聚糖蛋白，其由兩個相同的輕鏈（L)和兩個相同的重鏈（H)組成。每條輕鏈通過一 個共價二硫鍵與重鏈相連，而不同免疫球蛋白同種型的重鏈間的二硫鍵數目不同。每條重 鏈和輕鏈也有規則間隔的鏈內二硫鍵。每條重鏈的一端有可變區（VH)，其后是多個恒定區。 每條輕鏈的一端有可變區（VL)，另一端有恒定區；輕鏈的恒定區與重鏈的第一個恒定區相 對，輕鏈的可變區與重鏈的可變區相對。特殊的氨基酸殘基在輕鏈和重鏈的可變區之間形 成界面。
[0023] 本文所用的術語"可變"表示抗體中可變區的某些部分在序列上有所不同，它形 成各種特定抗體對其特定抗原的結合和特異性。然而，可變性并不均勻地分布在整個抗體 可變區中。它集中于輕鏈和重鏈可變區中稱為互補決定區（CDR)或超變區中的三個片段 中。可變區中較保守的部分稱為構架區（FR)。天然重鏈和輕鏈的可變區中各自包含四個 FR區，它們大致上呈β-折疊構型，由形成連接環的三個⑶R相連，在某些情況下可形成 部分β折疊結構。每條鏈中的⑶R通過FR區緊密地靠在一起并與另一鏈的⑶R -起形 成了抗體的抗原結合部位。恒定區不直接參與抗體與抗原的結合，但是它們表現出不同的 效應功能，例如參與抗體的依賴于抗體的細胞毒性。
[0024] 單克隆抗體可用本領域技術人員熟知的各種方法來制得。例如，單克隆抗體可用 雜交瘤方法制得，或用重組DNA方法制得，也可從噬菌體抗體庫中分離獲得。
[0025] 本發明還提供了編碼本發明重組抗NC08單克隆抗體的DNA分子。在一個較佳的 實例中，該DNA分子含有SEQ ID N0:3所示的編碼所述單抗輕鏈可變區的核苷酸序列，以及 SEQ ID N0:4所示的編碼所述單抗重鏈可變區的核苷酸序列。
[0026] 在獲得編碼本發明重組抗NC08單克隆抗體重鏈可變區和輕鏈可變區的核苷酸序 列后，通常可通過以下方法來制備本發明的單克隆抗體。
[0027] 首先，提供含有編碼本發明單克隆抗體的核苷酸序列的表達載體。
[0028] 編碼本發明單克隆抗體的DNA序列可用本領域技術人員熟知的常規手段來制得。 例如，可根據本發明公開的序列人工合成或用PCR法擴增得到編碼該單克隆抗體重鏈可變 區和輕鏈可變區的核苷酸序列。然后，用本領域熟知的各種方法通過選擇合適的酶切位點 將這些核苷酸序列插入合適的表達載體中，使它們分別在表達載體所攜帶的重鏈恒定區編 碼序列和輕鏈恒定區編碼序列之前，并使它們在同一閱讀框內。
[0029] 本發明中所用的表達載體是本領域技術人員己知的各種市售的表達載體，例如購 自Qiagen和Promega公司的表達載體，以及可購得的表達載體pMH3(杭州安瑞普生物制品 研宄有限公司）。
[0030] 隨后，用上述獲得的表達載體轉化合適的宿主細胞。"宿主細胞"一般包括原核細 胞和真核細胞。常用的原核宿主細胞的例子包括大腸桿菌、枯草桿菌等。常用的真核宿主 細胞包括酵母細胞，昆蟲細胞、和哺乳動物細胞。在本發明中，較佳的宿主細胞是CHO細胞。
[0031] 用表達載體轉化宿主細胞的方法有很多種，所用的轉化程序取決于待轉化的宿 主。將異源多核苷酸導入哺乳動物細胞中的方法是本領域所知的，其包括葡聚糖介導的轉 染、磷酸媽沉淀、Polybrene (1，5-二甲基-1，5-二氮^ -亞甲基聚甲溴化物)介導轉染、原 生質體融合、電穿孔、脂質體介導轉染以及將DNA直接顯微注射到胞核中。在本發明中，較 佳的方法是電穿孔法或脂質體介導法等。
[0032] 然后，在適合本發明單克隆抗體表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。用常規 的免疫球蛋白純化步驟，如蛋白A-Sepharose，羥基磷灰石層析、凝膠電泳、透析、離子交換 層析、疏水層析、分子篩層析或親和層析等本領域技術人員熟知的常規分離純化手段純化 得到本發明的重組抗NC08單克隆抗體。
[0033] 所得單克隆抗體可用常規手段來鑒定。單克隆抗體的結合特異性可用免疫沉淀或 體外結合試驗，如放射性免疫測定（RIA)或酶聯免疫吸附測定（ELISA)來測定。單克隆抗 體的結合親和力例如可用Scatchard分析方法來測定。
[0034] 本發明的優點在于本發明的單克隆抗體用于檢測NC08具有特異性強、靈敏度高 的優點，能在NC08進行臨床前研宄及臨床研宄的過程中，以及將來成為藥物后患者應用的 過程中，快速、準確檢測受試者(動物或人）或患者的血清NC 08濃度；還可用于檢測人抗 NC08抗體；在某些情況下，還可用于從現有產品中檢測有無 NC08的添加。
【附圖說明】
[0035] 圖1 :還原SDS-PAGE電泳檢測NC08 F (ab'）2純度，泳道1為制備所得NC08 F(abU1dt2SNC08。
[0036] 圖2 :載體pMH3_L，并且標明了其中的元件及酶切位點，其中，10C7-L為輕鏈基因； PolyA為多聚腺苷化信號；AmpR為氨芐青霉素抗性基因。
[0037] 圖3 :載體pMH3-H，并且標明了其中的元件及酶切位點，其中，10C7-H為重鏈基因， PolyA為多聚腺苷化信號；AmpR為氨芐青霉素抗性基因。
[0038] 圖4 :NC08濃度-OD值擬合曲線。
【具體實施方式】
[0039] 下面將結合實施例進一步詳細地描述本發明。然而應當理解，列舉這些實施例只 是為了起說明作用，而并不是用來限制本發明。
[0040] 實施例中未標明來源的實驗試劑均為市售。
[0041] 實施例1表達抗NC08鼠單抗的雜交瘤細胞系的制備和篩選 1)抗原NC08F(ab'） 2