述引物3和所述引物4在反應體系中的終濃度為0. 2 yM，所述引物 5和所述引物6在反應體系中的終濃度為0. 8 y M。所述反應體系具體可由2 y 1所述基因 組DNA與23ul所述試劑組成；在所述（b2)中，所述熒光顯色劑與所述待測樣品的反應液 的體積配比具體可為1:25。
[0028] 如下a)或b)的應用也屬于本發明的保護范圍：
[0029] a)所述引物組在制備所述試劑或所述試劑盒中的應用；
[0030] b)所述引物組或所述試劑或所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否 含有小反芻獸疫病毒的產品中的應用。
[0031] 所述待測樣品可為病毒樣品等。
[0032] 在本發明中，所述小反芻獸疫病毒具體為小反芻獸疫病毒新疆株。
[0033] 本發明具有以下優點：
[0034] 1)高特異性：6條引物對小反芻獸疫病毒靶序列的8個特異區域的識別保證了 LAMP擴增的高度特異性，即LAMP能從相差僅一個核苷酸的基因標本中找出相應的靶序列 進行擴增；
[0035] 2)高靈敏度：靈敏度比普通PCR高100倍；
[0036] 3)結果鑒定簡便：可通過肉眼觀察結果（鈣黃綠素顯色），也可以直接用濁度儀判 斷結果；
[0037] 4)操作簡單：只要將檢測樣品（靶核酸）和檢測試劑一起放入65°C恒溫水浴鍋中 50分鐘后就可以判斷結果；
[0038] 5)快速、高效擴增：整個LAMP擴增反應一小時內即可完成，且產率可達到0.5mg/ mL〇
[0039] 綜上所述，本發明可以在等溫條件下快速、方便、高效、高特異、高靈敏地檢測到小 反芻獸疫病毒，不需要復雜儀器，為小反芻獸疫病毒的檢測提供了一個新的技術平臺，可用 于畜牧業生產單位篩查和檢測小反芻獸疫病毒，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會 效益，適于大范圍推廣應用。
【附圖說明】
[0040] 圖1為6套引物組合的LAMP擴增曲線。
[0041] 圖2為本發明小反芻獸疫病毒LAMP檢測方法特異性的濁度儀檢測結果。
[0042] 圖3為本發明小反芻獸疫病毒LAMP檢測方法靈敏度的濁度儀檢測結果。其中，NC 表示陰性對照。
[0043] 圖4為本發明小反芻獸疫病毒LAMP檢測方法靈敏度的鈣黃綠素指示劑染色檢測 結果。從右到左，模板濃度依次為：107拷貝/ y 1，10 6拷貝/ y 1，10 5拷貝/ y 1，10 4拷貝/ yl，l〇^W/yl，l〇^W/yl，l〇^W/yl，l〇^W/yl，l〇_^W/yl，l〇_^W/ y 1，NC為陰性對照。
[0044] 圖5為本發明小反芻獸疫病毒LAMP檢測方法靈敏度的普通PCR檢測結果。M :DNA Marker為D2000 ; 1-10 :模板濃度依次為107拷貝/ y 1，10 6拷貝/ y 1，10 5拷貝/ y 1，10 4拷 貝 / yl，l〇3拷貝 / yl，l〇2拷貝 / yhlO1拷貝 / yl，l〇°拷貝 / yhlO-1 拷貝 / yl，l〇_2拷 貝/ y 1 ;NC :陰性對照。目標片段為203bp。
【具體實施方式】
[0045] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。
[0046] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。
[0047] 小反芻獸疫病毒新疆株：即"王清華，劉春菊，吳曉東等.新疆小反芻獸疫疫情 診斷.中國動物檢疫，2014年31卷第1期" 一文中記載的"新疆PPRV毒株"，公眾可從申 請人處獲得。
[0048] 實施例1、檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增引物的設計與合成
[0049] 從美國基因數據庫檢索獲得小反芻獸疫病毒N基因序列，通過BLAST軟件進行同 源性分析，獲得小反芻獸疫病毒的保守性靶序列，再根據該保守靶DNA序列，用軟件Primer design V4設計用于對小反芻獸疫病毒進行LAMP檢測的引物，設計并篩選出6套引物 (PV-0、PV-1、PV-3、PV-10、PV-16、PV-20)，經過實驗對比，最終選取了由6條引物組成的引 物組合PV-16,引物序列如表1所示。
[0050] 表1用于對小反芻獸疫病毒進行LAMP檢測的引物PV-16
【主權項】
1. 檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增引物組，為引物組A或引物組B;所述引物組 A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組B由所述引物1、所述 引物2、所述引物3和所述引物4組成； 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序 列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。
2. 檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA聚合酶、逆轉錄酶、 甜菜堿、dNTPs、Mg2+和權利要求1或2所述的引物組。
3. 根據權利要求3所述的試劑，其特征在于：所述引物1、所述引物2、所述引物3、所 述引物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述逆 轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol:40pmol:5pmol:5pmol:20pmol: 20pmol:35nmol:200nmol:8U:8U:20nmol;或 所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述dNTPs、所述Mg2+、所述鏈置換 型DNA聚合酶、所述逆轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol:40pmol: 5pmol:5pmol:35nmol:200nmol:8U:8U:20umol〇
4. 根據權利要求3所述的試劑，其特征在于：所述鏈置換型DNA聚合酶為BstDNA聚 合酶或BstDNA聚合酶大片段；或 所述逆轉錄酶為MLV逆轉錄酶。
5. 檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑盒，其特征在于：所述試劑盒含有權利 要求1所述的引物組，或權利要求2-4中任一所述的試劑。
6. 根據權利要求5所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒還包括熒光顯色劑。
7. 根據權利要求6所述的試劑盒，其特征在于：所述熒光顯色劑為含有鈣黃綠素和 MnCl2的水溶液； 所述焚光顯色劑中，所述媽黃綠素和所述此(]12的配比為0. 5mmol:10mmol。
8. 根據權利要求5-7中任一所述的試劑盒，其特征在于：所述試劑盒中還含有記載有 檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增方法的可讀性載 體； 所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增方法，包 括如下（a)和（b)的步驟： (a) 以從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，用權利要求1所述引物組進行環介導等 溫擴增； (b) 根據步驟（a)的擴增結果，按照如下（bl)或（b2)的方法確定所述待測樣品中是否 含有小反芻獸疫病毒： (bl)反應結束后，若所述待測樣品反應液出現白色沉淀物，則所述待測樣品中含有或 候選含有小反芻獸疫病毒；反之，則所述待測樣品不含或候選不含有小反芻獸疫病毒； (b2)反應結束后，向所述待測樣品的反應液中加入權利要求7中所述的熒光顯色劑， 然后觀察所述反應液的顏色變化； 若所述待測樣品反應液為綠色，則所述待測樣品中含有或候選含有小反芻獸疫病毒； 若所述待測樣品反應液為橙色，則所述待測樣品中不含有或候選不含有小反芻獸疫病毒。
9. 根據權利要求8所述的試劑盒，其特征在于：所述錄環介導等溫擴增反應為60-65°C 條件下的恒溫反應50min。
10.如下a)或b)的應用： a) 權利要求1所述的引物組在制備權利要求2-4中任一所述試劑或權利要求5-9中任 一所述試劑盒中的應用； b) 權利要求1所述的引物組或權利要求2-4中任一所述的試劑或權利要求5-9中任一 所述試劑盒在制備檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有小反芻獸疫病毒的產品中的應用。
【專利摘要】本發明公開了一種小反芻獸疫病毒的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。本發明所提供的用于檢測小反芻獸疫病毒的LAMP引物，為由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成的引物組A，或由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成的引物組B；所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物4、所述引物5和所述引物6的核苷酸序列分別為序列1、序列2、序列3、序列4、序列5和序列6。本發明為小反芻獸疫病毒的檢測提供了一個新的技術平臺，可用于畜牧業生產單位篩查和檢測小反芻獸疫病毒，具有廣闊的市場前景和較大的經濟、社會效益，適于大范圍推廣應用。
【IPC分類】C12R1-93, C12Q1-68, C12N15-11, C12Q1-70
【公開號】CN104789701
【申請號】CN201510170361
【發明人】于漢勛, 李廣焱, 楊卓, 李巍, 程淑晶, 于洋, 李奉京
【申請人】大連市動物疫病預防控制中心, 北京藍譜生物技術開發有限公司
【公開日】2015年7月22日
【申請日】2015年4月9日