小反芻獸疫病毒的lamp檢測方法及其專用引物組與試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬于生物技術領域中病毒的分子生物學檢測方法，特別是涉及小反芻獸疫 病毒的LAMP檢測方法及其專用引物與試劑盒。
【背景技術】
[0002] 小反合獸瘟病毒在分類上屬副粘病毒科，麻瘆病毒屬的一員。本病毒只有一個抗 原型，其抗原性與牛瘟病毒接近。經交叉血清中和試驗和補體結合試驗指出，補體結合抗體 和中和抗體對小反當獸病毒和牛瘟病毒都發生陽性反應，但對異源病毒的效價不如對同源 病毒的效價高。有人用瓊脂擴散試驗觀察到同源和異源系統都有兩條沉淀線，證明有共同 抗原，但因在沉淀線接合處出現交叉，所以認為兩者的抗原不是完全相同的。用豬麻瘆疫苗 免疫山羊，不能抵抗小反當獸瘟病毒的攻擊，而用犬瘟熱疫苗免疫可以抵抗小反當獸瘟病 毒的攻擊，但不能完全保護。病毒粒子呈近球形，大小為120-300納米，有囊膜，囊膜上有纖 突，為單股負鏈RNA病毒。用猴、牛、綿羊、山羊、馬、豬、犬、貓、雞、豚鼠等動物的紅細胞進行 血凝試驗均未證實有血凝活性。病毒對乙醚敏感，在PH3. 0條件下3小時滅活，嗅脫氧尿昔 對病毒無作用。病毒懸液在37°C的半衰期約為2小時，在50°C半小時即死亡。實驗感染山 羊尸體，在4°C保存8天后，從淋巴結內可見到本病毒，但滴度明顯下降。對外界環境的抵抗 力較弱，一般消毒藥均能殺死病毒。為此，開展小反芻獸疫病毒的實驗室診斷研宄具有重要 意義。目前用于小反芻獸疫病毒診斷的實驗室方法很多，如病毒的分離鑒定、免疫熒光抗體 技術、ABC-ELISA試驗和瓊脂擴散試驗等，其中瓊脂擴散試驗簡便、快速，常用于小反芻獸疫 病毒病毒或血清的檢查，但是其敏感性較低，很難在臨床上推廣應用。為此，急需建立一種 敏感、準確、快速、簡便的小反芻獸疫病毒實驗室診斷方法。雖然基于PCR技術的檢測方法 也已建立，但PCR需要昂貴的儀器，而且操作繁瑣。
[0003] 環介導的等溫核酸擴增技術（LAMP)是由T. Notomi (Notomi T, Okayama H, MasubuchiH, et al. Loop-mediated isothermal amplification of DNA. Nucleic Acids Res2000 ;28(12) :63.)發明的一種新型核酸擴增技術，該技術依賴4條特異設計的引物和 一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，在等溫條件下可以高效、快速、高特異地擴增靶序列。 近年來，國外已將該技術廣泛應用于病原體檢測。Masaki Imai等人（Imai M，Ninomiya A，Minekawa H，et al. Rapid diagnosis of H5N1 avian influenza virus infection by newly developed influenza H5 hemagglutinin gene-specific loop-mediated isothermal amplification method. J Virol Methods. 2007 ;141 (2):173-80.)利用 LAMP建立了禽流感病毒的實驗室確診：體系；Nobuyuki Hayashi等人（Hayashi N，Arai R，Tada S，Taguchi H, Ogawa Y.Detection and identification of Brettanomyces/ Dekkera sp.yeasts with a loop-mediated isothermal amplification method. Food Microbiol. 2007 ;24(7-8) :778-85.)針對四種香酒酵母的ITS序列設計了 LAMP特異性引 物，建立了高效的LAMP檢測體系。LAMP還可以檢測其它與人類相關的病毒，如病毒性出血 性敗血病（VHS)、巨細胞病毒（CMV)、埃博拉病毒（EBOV)、慢性伯基特淋巴瘤病毒（EBV)、虹 彩病毒、人類瘡瘆病毒8型、造血組織壞死病毒（IHHNV)、番茄斑萎病毒和番茄黃化曲葉病 毒等。但是迄今為止，市場上還未見用于檢測小反芻獸疫病毒的LAMP專用引物與試劑盒問 世。
【發明內容】
[0004] 本發明的一個目的是提供一種檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增引物組。
[0005] 本發明所提供的檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增引物組，具體可為引物組 A或引物組B。
[0006] 所述引物組A由引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6組成；所述引物組 B由所述引物1、所述引物2、所述引物3和所述引物4組成；
[0007] 所述引物l(FIP)、所述引物2(BIP)、所述引物3(F3)、所述引物4(B3)、所述引物 5(LF)和所述引物6(LB)的核苷酸序列分別為序列表中的序列1、序列2、序列3、序列4、序 列5和序列6。
[0008] 序列1由45個核苷酸組成，序列2由44個核苷酸組成，序列3由18個核苷酸組 成，序列4由18個核苷酸組成，序列5由20個核苷酸組成，序列6由21個核苷酸組成。
[0009] 本發明的第二個目的是提供一種檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑。
[0010] 本發明所提供的檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑，包括鏈置換型DNA 聚合酶、逆轉錄酶、甜菜堿、dNTPs、Mg 2+和所述引物組。
[0011] 當所述引物組為所述引物組A時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引 物4、所述引物5、所述引物6、所述dNTPs、所述Mg 2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述逆轉 錄酶和所述甜菜堿在所述擴增試劑中的配比為40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :20pmol : 20pmol ：35nmol ：200nmol ：8U ：8U ：20 umol〇
[0012] 當所述引物組為所述引物組B時，所述引物1、所述引物2、所述引物3、所述引物 4、所述dNTPs、所述Mg 2+、所述鏈置換型DNA聚合酶、所述逆轉錄酶和所述甜菜堿在所述擴增 試劑中的配比為 40pmol :40pmol :5pmol :5pmol :35nmol :200nmol :8U:8U:20ymol〇
[0013] 在本發明中，所述鏈置換型DNA聚合酶具體可為Bst DNA聚合酶或Bst DNA聚合 酶大片段。所述逆轉錄酶具體可為MLV逆轉錄酶。
[0014] 在本發明的一個實施例中，所述檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑組成 如下：每23 y 1所述試劑中含有各40pmol的所述引物1和所述引物2、各5pmol的所述引物 3和所述引物4、各20pmol的所述引物5和所述引物6、35nmol的dNTP、200nmol的MgS0 4、8U 的 Bst DNA 聚合酶、8U 的 MLV 逆轉錄酶、20ymol 的甜菜堿、500nmol 的 Tris .HCl(pH 8.8)、 250nmol 的 KCl、250nmol 的（NH4)2S04、0. 025 y 1 的 Tween20 ;余量為水。
[0015] 本發明的第三個目的是提供一種檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑盒。
[0016] 本發明所提供的檢測小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增試劑盒，含有所述引物 組，或所述試劑。
[0017] 所述試劑盒中還可含有熒光顯色劑。
[0018]所述熒光顯色劑可為含有鈣黃綠素和MnCl2的水溶液；所述熒光顯色劑中，所述鈣 黃綠素和所述此(]12的配比為0. 5mmol :10mmol。在本發明的一個實施例中，所述焚光顯色 劑具體為含有0. 5mmol/L的鈣黃綠素和10mm〇l/L的MnCl2的水溶液。
[0019] 所述試劑盒中還可含有記載有檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有鵝細小病毒 的環介導等溫擴增方法的可讀性載體。
[0020] 所述檢測或輔助檢測待測樣品中是否含有小反芻獸疫病毒的環介導等溫擴增方 法，包括如下（a)和（b)的步驟：
[0021] (a)以從待測樣品中提取的基因組DNA為模板，用所述引物組進行環介導等溫擴 增；
[0022] (b)根據步驟（a)的擴增結果，按照如下（bl)或（b2)的方法確定所述待測樣品中 是否含有小反芻獸疫病毒：
[0023] (bl)反應結束后，若所述待測樣品反應液出現白色沉淀物，則所述待測樣品中 含有或候選含有小反芻獸疫病毒；反之，則所述待測樣品不含或候選不含有小反芻獸疫病 毒；
[0024] (b2)反應結束后，向所述待測樣品的反應液中加入所述熒光顯色劑，然后觀察所 述反應液的顏色變化；
[0025] 若所述待測樣品反應液為綠色，則所述待測樣品中含有或候選含有小反芻獸疫病 毒；若所述待測樣品反應液為橙色，則所述待測樣品中不含有或候選不含有小反芻獸疫病 毒。
[0026] 在本發明中，所述環介導等溫擴增反應具體為60_65°C (如65°C )條件下的恒溫 反應50min〇
[0027] 在本發明中，進行所述環介導等溫擴增時，所述引物1和所述引物2在反應體系中 的終濃度為1. 6 yM，所