集后模板經純化后， 通過6條引物（引物3-引物8)，應用SNaPshot分型檢測技術，對14種亞型進行分型。 SNaPshot是一種基于單堿基延伸原理的基因分型新方法，可W同時對多種基因突變位點高 通量鑒別，方法為設計單條檢測探針，使其將要延伸的第一個堿基就是需進行基因分型的 位點，用巧光標記的雙脫氧NTPs(ddNTPs)作為測序底物，使其測序反應只延伸一個堿基， 從而能夠鑒定該SNP。SNaPshot能同時對7-8個不同的SNP位點進行96個樣本基因分型， 是一種快速、高通量的基因分型新方法，可加快基因分型的研究速度，該技術的出現為大規 模基因突變位點的篩查提供了一種快速、準確、高通量的診斷方法，彌補了基因巧片方法不 穩定、巧光定量PCR檢測數量有限等不足。
[0035] 本發明首次提供了一種同時對KPC1-KPC15共14種亞型的分型檢測方法，檢測通 量較傳統的定量檢測方法都高。準確度可與測序檢測方法相當，費用更低。 (四）【附圖說明】
[0036] 圖1KPC-2型菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、n口08C、nt272T、nt502G、 nt716A及nt814C。
[0037] 圖2KPC-3型菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、n口08C、nt272T、nt502G、 nt716A及nt814T。
[003引圖3KPC-4型菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、n口08G、nt272T、nt502G、 nt716C及nt814C。
[0039]圖4KPC-5型菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、n口08G、nt272T、nt502G、 nt716A及nt814C。
[0040] 圖5KPC-8型菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、n口08C、nt272T、nt502G、 nt716C及nt814T。
[0041] 圖6KPC-11型菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、nt308T、nt272T、nt502G、 nt716A及nt814C。
[0042] 圖7臨床收集的耐藥KPC菌株檢測結果，分型結果分別為；ntl47C、nt308C、 nt272T、nt502G、nt716A及nt814C。 (五）【具體實施方式】
[0043] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護范圍并不僅限于 此：
[0044] 實施例1KPC1-15的分型位點的選擇及引物設計
[0045]NCBI數據庫下載KPC1-15 序列（KPC-1 ;AF297554 ;KPC-2 ;GU086225 ;KPC-3 ; AF395881 ;KPC-4 ;FJ473382 ;KPC-4 ;AY700571 ;KPC-5 ;抓400222 ;KPC-6 ;抓5555：M;KPC-7 ; 抓729727 ;KPC-8 ;FJ234412 ;KPC-9 ;FJ624872 ;KPC-10 ;GQ140348 ;KPC-11 ;HM066995 ; KPC-12 ;冊641422 ;KPC-13 ;冊：M2889. 1 ;KPC-14 ;JX524191 ;KPC-15 ;KC433553)。序列經 Clusteri(比對之后，選擇了 6 個SNP位點（ntl47,nt272,nt308,n巧02,nt716 及nt814)。
[0046] 設計了一對大片段引物進行模板富集，其擴增區域包含所需要檢測的6個SNP位 點。Snapshot可W檢測多重的SNP，選擇6個位點做一個組合，對該些目的SNP位點進行引 物的設計。每個SNP設計的引物是延伸ddNTP，設計在SNP位點的上游或者是反向的下游。 具體見表1。KPC1-15的分型見表2。
[0047] 表1.大片段擴增引物及SNaPshot PCR引物
[0048]
【主權項】
1. 一種肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法，其特征在于所述方法為：以待測菌 株基因為模板，在引物1和引物2作用下進行PCR擴增反應，然后以擴增產物為模板，在引 物3-引物8的混合引物作用下進行SNaPshotPCR反應，對SNaPshotPCR產物進行測序； 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和814位均為C堿基，272位為T堿基，502位為 G堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-I或KPC-2 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、308位為C堿基，272位和814位為T堿基，502位為G堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-3 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、716位和814位為C堿基，在308位和502位為G堿 基，在272位為T堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-4 ; 若SNaPshotPCR產物在147位和814位為C堿基，在308位和502位為G堿基，在272 位為T堿基，在716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-5 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、308位、716位和814位為C堿基，在272位為T堿基， 在502位為G堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-6 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、272位和814位為T堿基，在308位為C堿基，在502 位為G堿基，在716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-7 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和716位為C堿基，在272位和814位為T堿 基，在502位為G堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-8 ; 若SNaPshotPCR產物在147位和308位為C堿基，在272位和814位為T堿基，在502 位和716位為G堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-9 ; 若SNaPshotPCR產物在147位為C堿基，在308位和502位為G堿基，在272位和814 位為T堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-IO; 若SNaPshotPCR產物在147位和814位為C堿基，在502位為G堿基，在308位和272 位為T堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-Il; 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和814位為C堿基，在272位和502位為T堿 基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-12 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和272位為C堿基，在502位為G堿基，在814 位為T堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-13 ; 若SNaPshotPCR產物在147位、308位、272位和814位為C堿基，在502位為G堿基， 716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-14 ; 若SNaPshotPCR產物在147位和716位為C堿基，在308位和502位為G堿基，在272 位和814位為T堿基，則待測菌株的碳青霉烯酶基因型為KPC-15 ; 引物 1 為：5' -CTGTATCGCCGTCTAGITCTGCTGT-3' ； 引物 2 為：5' -CAGAGCCTTACTGCCCGITGA-3' ； 引物 3 為：5' _(T)3GCGCCTGAGCCGGTATC-3' ； 引物 4 為：5' -(T)9GCAAAAATGCGCTGGITC-3' ； 引物 5 為：5' _(T)14CCGTAACGGATGGGTGTG-3' ； 引物 6 為：5' -(T)2(iGGGATGGCGGAGITCA-3' ； 引物 7 為：5' -(T)28GTCAITTGCCGTGCCATAC-3' ； 引物 8 為：5' _(T)38GCGCCTAACAAGGATGACAAG-3'。
2. 如權利要求1所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法，其特征在于所述PCR 擴增反應體系為：基因組DNAO. 5yL、反應混合物10.OyL，0. 1-3. 5yM引物混合物5.OyL、 5U/yL熱啟動Taq酶L0yL，SdH2O補足至25. 0yL;所述反應混合物為2. 5XPCR緩沖液、 MgCl2L2-3.OmM和dNTPs200yM。
3. 如權利要求1所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法，其特征在于所述PCR 擴增程序為95°C初始變性5分鐘，30個循環：94°C1分鐘，58°C1分鐘，72°C1分鐘；72°C終 延伸5分鐘，4°C保溫。
4. 如權利要求1所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法，其特征在于所述 SNaPshotPCR反應體系為：反應緩沖液ReactionMixO. 5yL，PCR產物2. 0yL，引物混合物 I. 0yL，水I. 5yL0
5. 如權利要求1所述肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法，其特征在于所述 SNaPshotPCR反應程序為：預變性96°C，10秒，96°C變性10秒，53°C延伸5秒，60°C30秒， 30個循環；終延伸60°C10秒，4°C保溫。
【專利摘要】本發明公開了一種肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法，所述方法為：以待測菌株基因為模板，在引物1和引物2作用下進行PCR擴增反應，然后以擴增產物為模板，在引物3-引物8的混合引物作用下進行SNaPshot PCR反應；根據SNaPshot PCR反應產物進行分型；本發明首次提供了一種同時對KPC1-KPC15共14種亞型的分型檢測方法，檢測通量較傳統的定量檢測方法都高，準確度可與測序檢測方法相當，費用更低。
【IPC分類】C12Q1-10, C12R1-22, C12Q1-68
【公開號】CN104774949
【申請號】CN201510188841
【發明人】朱海燕, 顧建忠, 葛斌文, 金大智, 吳方
【申請人】海寧市疾病預防控制中心, 浙江安寧生物科技有限公司
【公開日】2015年7月15日
【申請日】2015年4月20日