一種肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶基因型檢測方法
【專利說明】-種肺炎克雷伯菌碳青霉稀酶基因型檢測方法 (-)技術領域
[0001] 本發明設及一種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因型檢測方法。 (二）【背景技術】
[0002] 肺炎克雷伯菌化lebsiellapneumoniae)為常見院感病原菌，是臨床醫院感染重 點監測的病原菌之一。隨著碳青霉締類抗生素的大范圍使用，多藥耐藥株肺炎克雷伯菌不 斷出現。由肺炎克雷伯菌感染導致己西大規模流行的"超級細菌"事件使全球的目光又聚 焦到了 "多重抗生素耐藥"和"肺炎克雷伯菌"上。
[0003] 據報道，一些腸桿科屬細菌體內也發現攜帶肺炎克雷伯菌型碳青霉締酶，如大腸 埃希菌、沙口菌、陰溝腸桿菌、產酸克雷伯菌、沙雷菌等，使得利用臨床抗生素治療細菌感染 性疾病失敗或者造成治病療程延緩。肺炎克雷伯菌產生耐藥性的機理主要是菌體產生質粒 介導的超廣譜0-內酷胺酶巧SBLs)和頭抱菌素酶（AmpC酶），進而導致菌體外膜孔蛋白 丟失、抗菌藥物主動外排、生物被膜形成、基因變異等，因此針對于抑制上述兩種酶活性的 抗生素治療是解決肺炎克雷伯菌耐藥性的關鍵。碳青霉締類抗生素是目前臨床使用的抗 菌活性最強、抗菌譜最廣的一類抗生素，尤其對產超廣譜0-內酷胺酶和頭抱菌素酶的菌 株治療效果極佳，因此在臨床上被廣泛使用。隨著該類抗生素使用頻率的不斷提高，在世界 范圍內不斷出現了產碳青霉締酶肺炎克雷伯菌化lebsiellapneumoniaecarbapenemase， KPC)。碳青霉締酶是一種由質粒編碼并能夠被克拉維酸抑制的酶類，能夠水解碳青霉締類、 青霉素類、頭抱菌素類和氨曲南等抗生素，因此該類菌株的出現是導致臨床抗生素治療失 敗的主要原因。肺炎克雷伯菌型碳青霉締酶是近年來發現的新型碳青霉締酶類，屬于Bush 分類的2f組，Ambler分類的A類，能夠水解碳青霉締類、青霉素類、頭抱菌素類和氨曲南等 臨床常用的抗生素。肺炎克雷伯菌型碳青霉締酶基因位于可轉移的質粒上，可依靠質粒、整 合子、插入序列的基因元件進行傳播，該也是多藥耐藥菌株易于傳播的重要原因。
[0004] 目前有報道采用多重巧光定量PCR技術結合酶切的方法針對肺炎克雷伯菌KPC-2 和KPC-3型碳青霉締酶進行分型。最新的文獻報道采用多重巧光定量PCR結合分子信標技 術對11種類型的肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因進行區分。該11種碳青霉締酶基因型是由 5個不同的基因多態性位點構成。
[0005] 對于肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因分型及新基因篩查相關工作開展較少，國內并 無該方面研究，而且對于每種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因亞型的生物學功能尚不清楚。 (H)
【發明內容】
[0006] 本發明目的是提供一種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因型分類方法，該方法對肺炎 克雷伯菌碳青霉締酶化lebsiellapneumoniaecarbapenemase，KPC)基因KPC1-15 共 14 種亞型進行分型，該方法設及一對大片段擴增引物，六條SNaPshot檢測用引物，擴增結果 使用毛細管測序基因分析儀檢測，操作方便。
[0007] 本發明采用的技術方案是：
[000引本發明提供一種肺炎克雷伯菌碳青霉締酶基因型檢測方法，所述方法為；W待測 菌株基因為模板，在引物1和引物2作用下進行PCR擴增反應，然后W擴增產物為模板，在 引物3-引物8的混合引物作用下進行SNaPshotPCR反應，對SNaPshotPCR產物進行測 序；
[0009] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和814位均為C堿基（即胞喀晚），272位 為T堿基（即胸腺喀晚），502位為G堿基（即鳥嚷嶺），716位為A堿基（即腺嚷嶺），則待 測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-1或KPC-2;
[0010] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位為C堿基，272位和814位為T堿基，502位 為G堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-3;
[0011] 若SNaPshotPCR產物在147位、716位和814位為C堿基，在308位和502位為G 堿基，在272位為T堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-4;
[001引 若SNaPshotPCR產物在147位和814位為C堿基，在308位和502位為G堿基， 在272位為T堿基，在716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-5;
[0013] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位、716位和814位為C堿基，在272位為T 堿基，在502位為G堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-6;
[0014] 若SNaPshotPCR產物在147位、272位和814位為T堿基，在308位為C堿基，在 502位為G堿基，在716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-7;
[0015] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和716位為C堿基，在272位和814位為T 堿基，在502位為G堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-8;
[0016] 若SNaPshotPCR產物在147位和308位為C堿基，在272位和814位為T堿基， 在502位和716位為G堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-9;
[0017] 若SNaPshotPCR產物在147位為C堿基，在308位和502位為G堿基，在272位 和814位為T堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-10;
[0018] 若SNaPshotPCR產物在147位和814位為C堿基，在502位為G堿基，在308位 和272位為T堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-11;
[0019] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和814位為C堿基，在272位和502位為T 堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-12;
[0020] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位和272位為C堿基，在502位為G堿基，在 814位為T堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-13;
[0021] 若SNaPshotPCR產物在147位、308位、272位和814位為C堿基，在502位為G 堿基，716位為A堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-14;
[0022] 若SNaPshotPCR產物在147位和716位為C堿基，在308位和502位為G堿基， 在272位和814位為T堿基，則待測菌株的碳青霉締酶基因型為KPC-15;
[0023]引物 1 為；5' -CTGTATCGCCGTCTAGTTCTGCTGT-3,；
[0024]引物 2 為；5' -CAGAGCCTTACTGCCCGTTGA-3,；
[002引 引物 3 為；5，- (T)3GCGCCTGAGCCGGTATC-3'，（T)3表示有 3 個T，即（T)3為TTT;
[0026]引物 4 為；5, -(T)9GCAAAAATGCGCTGGTTC-3'，訊9含義同（T) 3;
[0027]引物 5 為；5' -(T)mCCGTAACGGATGGGTGTG-3'，（T) 14含義同訂）3;
[002引 引物 6 為；5, -(T)20GGGATGGCGGAGTTCA-3'，訊2。含義同（T) 3;
[0029]引物 7 為；5，- (T) 2sGTCATTTGCCGTGCCATAC-3 '，（T)28含義同（T) 3;
[0030]引物 8 為；5, -(T)3sGCGCCTAACAAGGATGACAAG-3,，（T) %含義同（T) 3。
[003U進一步，所述PCR擴增反應體系為；基因組DNAO.SuL、反應混合物lO.OuL， 0. 1-3. 5yM引物混合物5. 0yL、5U/yL熱啟動Taq酶1. 0yL，3地20補足至25. 0yL;所述 反應混合物為 2. 5XPCR緩沖液、MgClal. 2-3.OmM和dNTPs200uM。
[003引進一步，所述PCR擴增程序為95°C初始變性5分鐘，30個循環；94°C1分鐘，58°C1 分鐘，72°C1分鐘，72 °C終延伸5分鐘，4°C保溫。
[003引PCR產物經2.抓CIAP(寶生物堿性磯酸酶）和抓ExoI處理后，W美國生命科技 公司（lifetechnology)的ABIPRISMSNaPshotMultiplexKit進行反應，所述SNaPshot PCR反應體系為；反應緩沖液ReactionMixO. 5yLPCR產物2. 0yL引物混合物1. 0yL 水1. 5yL。所述SNaPshotPCR反應程序為；預變性96°C，10秒，96°C變性10秒，53°C延伸 5秒，60°C30秒，30個循環游延伸60°C10秒，4°C保溫。
[0034] 本發明首先從NCBI數據庫下載KPC1-15序列（KPC-1 ;AF297554 ;KPC-2 ; GU086225 ;KPC-3 ;AF395881 ;KPC-4 ;FJ473382 ;KPC-4 ;AY700571 ;KPC-5 ;抓400222 ;KPC-6 ; 抓555534;KPC-7 ;EU729727 ;KPC-8 ;FJ234412 ;KPC-9 ;FJ624872 ;KPC-10 ;GQ140348 ; KPC-11 ;HM066995;KPC-12 ;HQ641422 ;KPC-13 ;冊342889. 1 ;KPC-14JX524191 ;KPC-15 ; KC433553)，經序列比對之后，選擇了 6 個SNP位點（ntl47,nt272,nt308,nt502,nt716 及 n巧14)，該些位點可W將KPC1-KPC15分成14種不同的亞型（KPCl與KPC2基因型相同）； 其次設計一對大片段引物（引物1和引物2)對檢測模板進行富集，富