胞懸液，按每 孔150yL接種于96孔細胞培養板中，在37°C條件下，CO2體積分數為5%的培養箱中常規 培養24h后，隨機分為如下5個試驗組：（i)空白對照組；（ii)脂多糖模型組，也稱為 Lipopolysaccharide模型組，即LPS模型組；（iii)第一黃芪多糖模型組；（iv)第二黃芪 多糖模型組；（V)第三黃芪多糖模型組；每組3板重復；吸棄上清后，所述空白對照組加入 基礎培養液200yL，所述基礎培養液為含10%體積分數小牛血清的DMEM/F12培養液；所述 脂多糖模型組加入含100Ug/mL質量濃度脂多糖的培養液200yL;所述第一黃芪多糖模型 組加入含100yg/mL質量濃度脂多糖、lmg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液200yL;所述第 二黃芪多糖模型組加入含1〇〇Ug/mL質量濃度脂多糖、3mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液 200yL;所述第三黃芪多糖模型組加入含100yg/mL質量濃度脂多糖、5mg/mL質量濃度黃 芪多糖的培養液200yL; ② 取所述2-3代對數生長期奶牛乳腺上皮細胞制備成5XIO5-IXIO6個/mL的細胞懸 液，按每孔I. 5mL接種于6孔細胞培養板中，在37°C條件下，CO2體積分數為5%的培養箱 中常規培養24h后，隨機分為如下5個試驗組：（i)空白對照組；（ii)脂多糖模型組，即 LPS模型組；（iii)第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模型組；（V)第三黃芪多糖 模型組；每組3板重復；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎培養液2mL，所述基礎培養液 為含10%體積分數小牛血清的01^11作12培養液；所述1^3模型組加入含100 11§/1^質量濃 度脂多糖的培養液2mL;所述第一黃芪多糖模型組加入含100yg/mL質量濃度脂多糖、Img/ mL質量濃度黃芪多糖的培養液2mL;所述第二黃芪多糖模型組加入含100yg/mL質量濃度 脂多糖、3mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液2mL;所述第三黃芪多糖模型組加入含100yg/ mL質量濃度脂多糖、5mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液2mL。 (3) CCK-8法檢測所述步驟（2)中的①中所述5個試驗組中細胞存活率； (4) 流式細胞術檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞周期； (5) 瓊脂糖凝膠電泳檢測所述步驟⑵中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞DNA ladder 條帶； (6) 透射電鏡觀察所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞內部超微結 構的變化； (7) 放射免疫法檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中細胞上清液中炎癥相關 細胞因子含量； (8) 生化試劑盒法檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中細胞上清液中炎癥相 關酶酶活。
2. 根據權利要求1所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（1)具體包括如下步驟： 采用組織塊培養法獲得奶牛乳腺上皮細胞，用含10%體積分數小牛血清的DMEM/F12 培養液作為基礎培養基，于37°C、C02體積分數為5%的培養箱中培養，經純化后取2-3代對 數生長期細胞用于后續試驗。
3. 根據權利要求1所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（3)具體包括如下步驟： 所述步驟（2)中的①中得到的5個試驗組分別繼續培養8h后，每孔加入10yL的CCK-8 溶液，繼續孵育1~4h，觀察培養基顏色變化，在全自動酶標儀測定各孔在490nm處的吸光 度值，分別計算得到所述5個試驗組細胞抑制率、細胞存活率，所述細胞抑制率的計算方法 為：細胞抑制率=1-(試驗組OD值/對照組OD值）X100 %，細胞存活率=1-細胞抑制率； 對照組的細胞存活率定義為100%。
4. 根據權利要求1所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（4)具體包括如下步驟： 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續培養8h后，分別進行胰酶消化 得到單細胞懸液并分別移至離心管中進行第一次離心，所述第一次離心為在室溫條件下 1500rpm離心5min，小心吸除上清液后，再分別加入ImLPBS吹打細胞沉淀后轉移至流式上 樣管中，再次離心并吸除上清，所述再次離心與所述第一次離心條件相同，所述吸除上清液 時留50yL上清液以免吸走細胞，得到細胞周期待測樣品；將所述細胞周期待測樣品分別 進行流式細胞術檢測。
5. 根據權利要求1所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（5)具體包括如下步驟： 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續培養8h后，分別胰酶消化收集細 胞，分別用酚-氯仿-異戊醇法抽提細胞DNA，于1 %瓊脂糖凝膠中電泳，檢測細胞DNA完整 性。
6. 根據權利要求1所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（6)具體包括如下步驟： 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續培養8h后，分別胰酶消化收集細 胞，用質量分數為2. 5%的戊二醛固定，清洗數次后再用1 %鋨酸固定；然后分別進行脫水， 所述脫水為先用質量分數為50% -70%的酒精逐級脫水，再用質量分數為80% -100%的 丙酮逐級脫水；脫水后分別用Epon812樹脂包埋，制成Iym半薄切片，再用甲苯胺蘭染色， 組織定位后制成70-80nm超薄切片，用醋酸鈾-枸櫞酸鉛將所述超薄切片雙重染色，分別 在JSM-6700F透射電鏡下觀察所述5個試驗組乳腺上皮細胞內部超微結構形態及其凋亡情 況。
7. 根據權利要求1所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（7)具體包括如下步驟： 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續培養8h后，分別收集各組細胞 上清液，放射免疫法檢測所述各組細胞上清液中炎癥相關細胞因子TNF-a、IL-I0、IL-6、 IL-2的質量分數，單位分別依次為pg/mL、ng/mL、pg/mL、ng/mL。
8. 根據權利要求I所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其特征 在于，所述步驟（8)具體包括如下步驟： 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續培養8h后，分別收集各組細胞上 清液，生化試劑盒法檢測各組細胞上清液中炎癥相關酶NAGase、AKP、MPO、iNOS的酶活，單
【專利摘要】本發明公開了一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，包括如下步驟：(1)2-3代奶牛乳腺上皮細胞的獲取；(2)細胞的分組及處理；(3)CCK-8法檢測細胞存活率；(4)流式細胞術檢測細胞周期；(5)DNA ladder檢測凋亡細胞核酸的變化情況；(6)透射電鏡觀察細胞內部形態結構變化；(7)放射免疫法檢測細胞上清液中炎癥相關細胞因子含量；(8)生化試劑盒法檢測細胞上清液中炎癥相關酶活。通過本發明所述方法對黃芪多糖拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡的作用進行探討，高效、簡便、可行且結果精確。
【IPC分類】C12Q1-02
【公開號】CN104762364
【申請號】CN201510173278
【發明人】丁月云, 殷宗俊, 張曉東, 孟云, 張威, 付坤, 張夢琦, 黃龍, 王源朗, 朱樹嬌
【申請人】安徽農業大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年4月13日