黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種黃芪多糖的應用方法；尤其涉及一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上 皮細胞凋亡中的應用方法。
【背景技術】
[0002] 奶牛乳腺炎嚴重影響奶牛的產奶量，降低牛奶品質，危害消費者健康，且延長奶牛 產后發情期，增加奶牛淘汰率，從而降低奶牛養殖業經濟效益。目前，關于奶牛乳腺炎的治 療手段很多，如化學藥物療法、基因工程疫苗治療、細胞因子治療、細菌素治療、激素治療及 抗奶牛乳腺炎病原菌復合卵黃抗體治療等。這些方法各有所長，雖不能徹底治愈，但都能起 到一定療效。然而這些方法的副作用卻不容忽視，特別是藥物殘留，間接危及人類健康。因 此，如何利用生物活性物質調動乳腺組織自身的防御機制，從而調節乳腺的健康水平成為 奶牛乳腺炎防治研宄的熱點。
[0003] 乳腺上皮細胞是構成乳腺的主要功能細胞，也是宿主機體抵御病原微生物入侵乳 腺時的第一道防御屏障。脂多糖（Lip 〇p〇lysaCCharide，LPS)，是革蘭氏陰性菌（G-)細胞外 膜上一種大分子結構成分。牛的乳腺對LPS的刺激非常敏感，乳腺內灌注LPS，能夠誘導明 顯的乳房炎癥狀，同時可增加血液和乳汁中脂多糖結合蛋白和可溶性CD14的水平及炎性 因子的釋放，其誘發的炎癥反應和G-菌感染乳腺引起的炎癥反應有著極其相似的地方，因 此在臨床上有著極為廣泛的應用。且已有研宄報道表明，在體外經LPS刺激，奶牛乳腺上皮 細胞亦能分泌炎癥相關的介質來介導細胞損傷。
[0004] 中草藥及其活性有效成分在治療奶牛乳房炎的臨床實踐中早有報道。相關報道表 明，黃芪多糖對奶牛乳腺炎的防治具有潛在的研宄和開發價值。鐘凱等研宄黃芪多糖對大 腸桿菌內毒素脂多糖誘發實驗性山羊、奶牛和大鼠乳腺炎的影響，結果表明，乳房局部灌注 黃芪多糖或灌喂動物黃芪多糖，均能減輕大腸桿菌內毒素脂多糖對乳腺組織的破壞，對脂 多糖誘發的動物實驗性乳腺炎有一定的保護作用。
【發明內容】
[0005] 本發明提供了一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，本發明 方法具有高效、簡便、可行且結果精確的優點。
[0006] 一種黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，包括如下步驟：
[0007] (1)培養奶牛乳腺上皮細胞，獲取2-3代對數生長期細胞用于后續試驗；
[0008] (2)細胞的分組及處理：
[0009] ①取所述2-3代對數生長期奶牛乳腺上皮細胞制備成1 X 104個/mL的細胞 懸液，按每孔150 yL接種于96孔細胞培養板中，在37°C條件下，C02體積分數為5%的 培養箱中常規培養24h后，隨機分為如下5個試驗組：（i )空白對照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii )第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模 型組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎 培養液200 111，所述基礎培養液為含10%體積分數小牛血清的01^11/^12培養液；所述1^3 模型組加入含100 y g/mL質量濃度LPS的培養液200 y L ;所述第一黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質量濃度LPS、lmg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液200 y L ;所述第二黃芪多糖 模型組加入含100 U g/mL質量濃度LPS、3mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液200 y L ;所述 第三黃芪多糖模型組加入含100 U g/mL質量濃度LPS、5mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液 200 y L ；
[0010] ②取所述2-3代對數生長期細胞制備成5X 105-1 X 106個/mL的細胞懸液， 按每孔1. 5mL接種于6孔細胞培養板中，在37 °C條件下，C02體積分數為5 %的培養 箱中常規培養24h后，隨機分為如下5個試驗驗組：（i )空白對照組；（ii )脂多糖 (Lipopolysaccharide，LPS)模型組；（iii)第一黃芪多糖模型組；（iv )第二黃芪多糖模型 組；（v )第三黃芪多糖模型組；每組3板重復；吸棄上清后，所述空白對照組加入基礎培養 液21^，所述基礎培養液為含10%體積分數小牛血清的01^11/^12培養液；所述1^3模型組 加入含100 y g/mL質量濃度LPS的培養液2mL ;所述第一黃芪多糖模型組加入含100 y g/ mL質量濃度LPS、lmg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液2mL ;所述第二黃芪多糖模型組加入含 100 y g/mL質量濃度LPS、3mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液2mL ;所述第三黃芪多糖模型 組加入含100 U g/mL質量濃度LPS、5mg/mL質量濃度黃芪多糖的培養液2mL。
[0011] (3)CCK-8法檢測所述步驟（2)中的①中所述5個試驗組中細胞存活率；
[0012] (4)流式細胞術檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞周 期；
[0013] (5)瓊脂糖凝膠電泳檢測所述步驟⑵中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞 DNA ladder 條帶；
[0014] (6)透射電鏡觀察所述步驟⑵中的②中所述5個試驗組中乳腺上皮細胞內部超 微結構的變化；
[0015] (7)放射免疫法檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中細胞上清液中炎癥 相關細胞因子含量；
[0016] (8)生化試劑盒法檢測所述步驟（2)中的②中所述5個試驗組中細胞上清液中炎 癥相關酶酶活。
[0017] 本發明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（1)具體包括如下步驟：
[0018] 采用組織塊培養法獲得奶牛乳腺上皮細胞，用含10%體積分數小牛血清的DMEM/ F12培養液作為基礎培養基，于37°C、C0 2體積分數為5%的培養箱中培養，經純化后取2-3 代對數生長期細胞用于后續試驗。
[0019] 本發明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（3)具體包括如下步驟：
[0020] 所述步驟⑵中的①中得到的5個試驗組分別繼續培養8h后，每孔加入10yL的 CCK-8溶液，繼續孵育1~4h，觀察培養基顏色變化，在全自動酶標儀測定各孔在490nm處 的吸光度值，分別計算得到所述5個試驗組細胞抑制率、細胞存活率，所述細胞抑制率的計 算方法為：細胞抑制率=1-(試驗組0D值/對照組0D值）X 100 %，細胞存活率=1-細胞 抑制率；對照組的細胞存活率定義為100%。
[0021] 本發明所述黃芪多糖在拮抗奶牛乳腺上皮細胞凋亡中的應用方法，其中，所述步 驟（4)具體包括如下步驟：
[0022] 所述步驟（2)中的②中得到所述5個試驗組分別繼續培養8h后，分別進行胰酶消 化得到單細胞懸液并分別移至離心管中進行第一次離心，所述第一次離心為在室溫條件下 1500rpm離心5min，小心吸除上清液后，再分別加入lmL PBS吹打細胞沉淀后轉移至流式上 樣管中，再次離心并吸除上清，所述再次離心與所述第一次離心條件相同，所述吸除上清液 時留50 y L上清液以免吸走細胞，得到細胞周期待測樣品；將所述細胞周期待測樣品分別 進行流式細胞術檢測。
[0023] 本發明所述黃芪多糖在拮抗奶牛