，可見菌落為淡黃色，菌落表面光滑，邊緣整 齊，不透明，菌液粘稠（見圖1)。革蘭氏染色為陰性。電子顯微鏡觀察表明，菌體呈短桿狀 (見圖2)。生化反應證明其培養基內可以產氣，可水解卵磷脂、凝膠和脂質，不能水解尿素， 鼠李糖培養可產酸，檸檬酸培養不產酸，〇°C下不生長等。
[0036] (2) YM8的分子生物學鑒定
[0037] 將YM8菌株于NB培養液（牛肉膏3. Og/L，蛋白胨10.0 g/L，NaCl 5. Og/L，補充蒸 餾水至1L;調pH至7. 2)中搖培48h后收集菌體，米用10mM的tris-HCl (購自Amresco公 司產品）和ImM的EDTA提取基因組DNA(de Silva et al. 1998)，提取后用苯酚-氯仿-異 戊醇（25:24:1)抽提和TER溶解。利用特異性引物擴增16s rDNA并送深圳華大公司進行 測序。測序序列長度為1508bp，具體序列如SEQ ID N0. :1所示。
[0038] 測序引物的DNA序列：
[0039] 16S rDNA(正向引物）：AGAGITTGATCCTGGCTC
[0040] 1防rDNA(反向引物）：AAGGAGGTGATCCAGCCGCA
[0041] 在Genbank數據庫中，將YM8菌株的16s rDNA序列進行BLAST檢索，發現其與希 瓦氏菌屬內不同種的細菌菌株相似度較高，為進一步確定該菌株的遺傳特性，選取比對結 果中同源性較高的菌株構建系統發育樹。
[0042]根據其形態和生化特征，以及16S rDNA基因序列系統發育分析（圖3)，經鑒定本 發明所分離的菌株是一株海藻希瓦氏菌（Shewanella algae)，申請人將該菌株命名為海藻 希瓦氏菌YM8，Shewanella algae YM8,于2015年3月17日將該菌株送交中國.武漢.武 漢大學中國典型微生物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC N0:M 2015120。
[0043] 實施例2海藻希瓦氏菌YM8對黃曲霉的抑菌作用
[0044] 篩選菌株YM8對黃曲霉菌絲生長的抑制作用采用培養皿（直徑9cm)對扣的方式 中進行。其中黃曲霉于PDB培養基（去皮馬鈴薯200. 0g沸水煮20min后紗布過濾收集濾 液，添加葡萄糖20. 0g，蒸餾水定容至1L，自然pH，即不調pH)培養三天后，挑取白色的菌絲 團，接種于含？〇4的培養皿中央。菌株￥118(100^1，10 8〇包/1111)涂布于另一個含嫩培養基 的培養皿表面。將接種黃曲霉菌絲塊的培養皿對扣于涂布YM8的培養皿之上，透明膠帶封 口保存。以僅接種黃曲霉菌絲塊的處理作為對照，每個處理有3個重復，28°C黑暗條件下培 養5天后計算不同處理的菌絲直徑并計算抑菌率。
[0045] 抑菌率的計算公式如下：
[0046] 菌絲生長抑菌率=(對照菌絲直徑-處理菌絲直徑）/對照菌絲直徑X 100 %。
[0047] 菌株YM8對黃曲霉孢子萌發的抑制作用采用培養皿對扣培養法，100 y 1黃曲霉孢 子（5 X 105cfu/ml)涂布于含PDA培養基的平皿表面，菌株YM8(100y 1，108cfu/ml)涂布于 含NA培養基的培養皿表面。將接種黃曲霉孢子液的培養皿對扣于接種YM8菌液的培養皿 之上，以僅接種黃曲霉孢子的處理作為對照，透明膠帶封口保存。28°C黑暗條件下培養1天 后顯微鏡觀察，記錄孢子萌發個數，以萌發產生的菌絲長度大于孢子直徑的作為已萌發。計 算不同處理的孢子萌發率，并計算YM8對孢子萌發的抑制率。
[0048] 計算公式如下：
[0049] 孢子萌發抑制率=(對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率 X 100%〇
[0050] 海藻希瓦氏菌YM8與黃曲霉菌絲在密封培養皿內無接觸培養過程中，可以產生揮 發性的氣體物質，完全抑制黃曲霉菌絲的生長，YM8對菌絲生長抑菌率達100% (圖4)。海藻 希瓦氏菌YM8在與菌絲的共培養過程中，通過產生抑菌氣體物質可完全抑制孢子的萌發， 當培養12h后，對照組的孢子已萌發長出菌絲，但YM8處理組的孢子未見萌發（圖5)。繼續 培養48h后，對照組萌發的菌絲形成菌絲團，覆蓋培養基的的表面，YM8處理組仍未見孢子 萌發。YM8對孢子萌發的抑菌率達100% (圖4)。
[0051] 實施例3活性炭對海藻希瓦氏菌YM8抑菌作用的影響
[0052] 鑒于活性炭作為一種揮發性物質的吸附劑，我們將活性炭添加到菌株YM8與黃曲 霉的共培養試驗中。方法是，中間有分隔的9cm培養皿的一端添加5g活性炭，另一端涂布 YM8菌液（50 y 1，108cfu/ml)，黃曲霉的菌絲塊接種于另一個含有PDA培養基的培養皿中 央。將接種黃曲霉菌絲塊的培養皿倒置扣于添加活性炭和YM8的培養皿之上。試驗中采用 如下所述的四個處理：（1):黃曲霉菌絲塊；（2)黃曲霉菌絲塊+活性炭；(3)黃曲霉菌絲塊 +YM8 ; (4)黃曲霉菌絲塊+活性炭+YM8。每個處理設置3個重復，封口后于28°C黑暗條件 下培養5天后，檢測菌絲直徑并計算抑菌率。
[0053] 共培養5天后檢測，對照組黃曲霉菌絲直徑達5. 37cm，添加活性炭后菌絲直徑為 5. 35cm，二者無顯著差異，說明活性炭對黃曲霉菌絲的生長無抑制作用。黃曲霉與YM8共培 養5天后菌絲直徑為0cm，但體系中添加活性炭后菌絲直徑為3. 20cm，表明YM8密閉體系中 可以產生揮發性的氣體物質，并抑制黃曲霉的生長，當代謝產物達到一定濃度時，抑菌率達 到100%，但反應體系中添加活性炭，作為揮發性物質吸附劑，可以減少有效物質的濃度，降 低了對黃曲霉的抑制率（圖6)。試驗表明YM8產生的抑菌氣體物質是抑制黃曲霉生長的關 鍵因素，而并非其他生防機制（如競爭空間，氧氣等）。
[0054] 實施例4海藻希瓦氏菌YM8揮發性氣體檢測
[0055] 將菌株YM8接種于100ml三角瓶中的NA培養基表面，涂布均勻。瓶口用雙層塑料 薄膜封閉，以不接種YM8的三角瓶作為對照，所有三角瓶置于28°C黑暗條件下培養48h。培 養后的三角瓶轉移到40°C的水浴鍋中平衡30min。之后依次進行樣品的萃取和GC-MS檢測。
[0056] 樣品萃取方法：
[0057] 采用固相微萃取柱（SPME)進行揮發性物質的富集。將SPME的萃取頭插入塑料薄 膜之內，推出纖維頭，使纖維頭處于樣品瓶上空的中間位置，吸附30min。將纖維頭收回萃取 頭，并拔出樣品瓶后轉入氣相色譜質譜聯用儀（GC-MS)進樣檢測，檢測參數設計如下。
[0058] GC 條件：
[0059] 進樣口溫度為250°C;載氣為氦氣，柱流速lmL/min;不分流進樣。程序升溫條件： 起始溫度為40°C，保持3min后，以3°C /min的速度升溫至160°C，同樣保持2min，再以8°C / min 速率升至 220°C，保持 3min。J&WHP - 5MS 彈性石英毛細管柱（30mX0. 25mm ID，0. 25um thickness film)〇
[0060] MS 條件：
[0061] 離子源溫度為230 °C，四極桿溫度150 °C，電離方式：El源，能量為70eV，采用 全掃描的模式進行檢測，檢測范圍為50-550amu。檢測物質自動進行譜庫檢索National Institure of Standards and Technology(NIST 08)，對檢測的物質進行定性。
[0062] GC-MS檢測后，YM8培養試劑瓶檢測到的物質，扣除NA培養基對照組中檢測到的氣 體物質，即為YM8產生的揮發性氣體組分。試驗中YM8共計檢出15種物質（圖7)，如表1 所示。15種物質中含有芳香族化合物，烷類化合物，硫化物，烯醇類，噁唑類，蒽類，酯類以及 酚類物質等。鑒定出的物質是分子量介于97-342道爾頓（D)之間的小分子物質，易于揮發。 其中組分4 (二甲基三硫）是豐度最高的產物，相對峰面積達14. 195%，其他物質豐度相對 較低。為研宄15種產物中主要的抑菌成分，我們將相對豐度在0.5%以上，NIST 08譜庫比 對相似度高于70%的六種物質購買了標準品，以進行后續的抑菌試驗。六種物質的編號和 名稱分別為2 (壬烷），4 (二甲基三硫），5 (2-十二烷醇），10 (2,4-二甲基噁唑），14 ( 丁基 羥基甲苯），15(2, 4-二叔丁基苯酚）（圖7)。
[0063] 表1 GC-MS檢測YM8代謝產物
【主權項】
1. 一株對黃曲霉菌及毒素具有高效抑制作用的海藻希瓦氏菌（Shewanellaalgae) YM8,保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏號為CCTCCNO:M2015120。
2. 如權利要求1所述的菌株，其特征在于，該菌株的16SrDNA的核苷酸序列如序列表 SEQIDNO:1 所示。
3. -種防治黃曲霉菌侵染及毒素產生的海藻希瓦氏菌的代謝產物的鑒定，其特征在于 所述的海藻希瓦氏菌（Shewanellaalgae)YM8產生的揮發性代謝物質具有抑菌作用。
4. 如權利要求1或2所述的菌株在防治倉儲期不同水活度下花生和玉米黃曲霉菌和毒 素的中的應用。
5. 權利要求1或2所述的菌株在制備防治作物儲藏期霉菌和毒素制劑中的應用。
【專利摘要】本發明屬于植物病害生物防治技術領域，具體涉及防治作物儲藏期黃曲霉菌及毒素的海藻希瓦氏菌及其應用。本發明包含了該海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)YM8的鑒定、以及廣譜和廣溫范圍內的抑菌作用，同時鑒定了該菌株產生的抑菌氣體代謝產物，并進行了抑菌活性分析等。本發明分離的海藻希瓦氏菌YM8保藏在中國典型培養物保藏中心(CCTCC)，保藏編號為CCTCC NO：M2015120。本發明還檢測了不同水活度的倉儲環境下，該菌株YM8在抑制花生與玉米黃曲霉病害與毒素污染中的應用。CCTCC NO：M 201512020150317
【IPC分類】C12R1-01, C12N1-20, A23B9-28, C12Q1-18
【公開號】CN104762230
【申請號】CN201510133782
【發明人】廖玉才, 宮安東, 李和平, 張靜柏
【申請人】華中農業大學
【公開日】2015年7月8日
【申請日】2015年3月26日