防治作物儲藏期黃曲霉菌及毒素的海藻希瓦氏菌及其應用
【技術領域】
[0001] 本發明屬于植物病害生物防治技術領域，具體涉及一株防治儲藏期黃曲霉菌侵染 和毒素產生的海藻希瓦氏菌及其應用，本發明還涉及該海藻希瓦氏菌YM8的篩選、鑒定、廣 譜抑菌作用、抑菌氣體代謝物檢測及活性分析等，同時驗證了不同水活度的倉儲條件下，該 菌株在抑制花生與玉米黃曲霉病害與毒素污染中的應用。
【背景技術】
[0002] 黃曲霉菌（Aspergillus flavus)是一種廣泛分布的腐生真菌。根據有性階段將 其劃分到子囊菌門（Ascomycota)、散囊菌目（Eurotiales)、發菌科（Trichocomaceae)、石 座菌屬（Petromyces)。黃曲霉菌生長的最適水活度為0. 86 - 0. 96,最適溫度為37°C，且在 12°C -48°C的溫度范圍內均可生長（Hedayati et al.，2007)。在煒度26° -35°的溫帶 氣候地區黃曲霉菌是非常普遍的土壤微生物和植物病原菌，對惡劣環境的強適應能力使得 黃曲霉菌成為土壤中和植物上的優勢微生物。在我國，黃曲霉菌的分布受氣候影響明顯，我 國長江流域和東南沿海地區的土壤中黃曲霉菌的種群數量明顯多于黃河流域和東北地區 (張初署，2013)。
[0003] 黃曲霉菌既可以侵染花生、玉米、棉花等多種重要的經濟作物，引起花生苗腐、玉 米穗腐等田間病害，又可嚴重為害儲藏過程中的糧食，造成重大的經濟損失。黃曲霉菌還 是人類和動物的致病菌。對于免疫力低下的人群，黃曲霉菌感染會引起侵襲性曲霉病，造 成皮膚、角膜、呼吸系統、循環系統和神經系統的疾病。黃曲霉菌還可以引起其他哺乳動物 和鳥類的曲霉病。黃曲霉菌在生長過程中還會產生大量的黃曲霉毒素，該毒素是一種劇毒 并且具有強烈致癌、致畸作用的微生物毒素，它對糧食、飼料等農產品的污染會嚴重危害人 類和動物的健康。由于食用受黃曲霉污染的花生飼料導致了超過10萬只火雞黃曲霉毒素 急性中毒死亡。據統計全世界受黃曲霉毒素危害的人口達50億，在發展中國家黃曲霉毒 素污染尤為嚴重，人們在日常生活中長期受超過限量標準的黃曲霉毒素威脅（Williams et al.，2004)。由微生物產生的黃曲霉毒素主要有4種分別為黃曲霉毒素& (AFBD、B2 (AFB2)、 GJAFGD、G2(AFG2)。黃曲霉毒素是一類劇毒化合物并具有強烈的致癌性，AFBi是最常見的 黃曲霉毒素同時也是自然界中致癌性最強的化合物之一。一次性大劑量吸入或攝入黃曲霉 毒素可以引起急性中毒導致死亡。黃曲霉毒素污染糧食導致人中毒的現象在發展中國家尤 為嚴重，在肯尼亞就發生過因食用黃曲霉毒素污染的玉米導致數百人死亡的事件。在美國 發生過多例寵物狗因黃曲霉毒素中毒死亡的事件。長期接觸黃曲霉毒素會誘發癌癥（主要 是肝癌）、破壞免疫系統，引起畸形等一系列不良影響。黃曲霉毒素已經于1993年被國際 癌癥研宄中心（IARC，International Agency for Research on Cancer)認定為 I 類致癌 物。世界上許多國家制定了嚴格的標準來限制黃曲霉毒素在食品中的殘留。美國FDA組織 (Food and Drug Administration)規定在食品中黃曲霉毒素含量不得超過20yg/kg，牛奶 中不得超過〇. 5 y g/kg，飼料中不得超過300 y g/kg。歐盟對食品中黃曲霉毒素的限制標準 為4 yg/kg。因此黃曲霉毒素的污染將會給農業和畜牧業帶來巨大的經濟損失，在美國每年 因黃曲霉毒素污染造成的經濟損失高達數億美元。
[0004]目前黃曲霉及毒素的防治方法有常規育種、化學防治與生物防治三種手段。通過 育種手段可以將數量性狀抗病基因整合到感病品種，選育新型的抗病新品種。近年來一些 重要的黃曲霉抗性相關QTLs陸續被定位，證明了基因的疊加效應能夠增強植物對黃曲霉 菌的抗性。但總體而言，黃曲霉抗病材料匱乏，抗性基因的篩選與整合以及育種周期較長， 使得常規育種進展緩慢。化學防治作為最直接有效的手段被廣泛應用于黃曲霉的田間及儲 藏期的防治，但是長期的應用易引起藥害和病原菌的抗藥性，甚至污染環境。另外糧食作物 上直接噴灑化學農藥容易導致殘留，影響人體健康，在使用過程中飽受詬病。微生物源生物 制劑作為新型無危害的的防治策略，被逐漸開發和應用于黃曲霉和毒素的田間和儲藏期防 治中。利用黃曲霉弱毒菌株或不產毒素菌株的競爭優勢，可以優先占據了生態龕位，防止黃 曲霉感病菌株的侵染和毒素的進一步產生，對黃曲霉的田間和儲藏期防治效果明顯。目前 基于此開發的一種生防制劑af!a-guardK已經應用到花生黃曲霉病害防治當中（Dorner and Lamb，2006)。近年來利用微生物產生的揮發性氣體防治儲藏期病害發展迅速，微生物源的 揮發性氣體因為其使用簡單，散布均勻快速，接觸廣泛等優點被高效應用于儲藏期病害的 生物防治。但是對黃曲霉及毒素的儲藏期防治沒有報道，基于此目的我們篩選了微生物菌 株，研宄其產氣特性和抑菌作用，并開展儲藏期黃曲霉毒素防治的研宄。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在于針對花生與玉米等作物倉儲期黃曲霉菌和黃曲霉毒素防治困 難，污染和經濟損失嚴重的難題開展研宄，利用微生物學方法分離鑒定一株高效防治黃曲 霉菌和毒素污染的希瓦氏菌株YM8,利用該海藻希瓦氏菌株在培養基上產生的具有抑菌作 用的小分子揮發性代謝物質，可有效抑制花生和玉米等作物上黃曲霉病菌的侵染與毒素的 產生。
[0006] 實現本發明的技術方案如下所述：
[0007] 通過微生物學方法，本發明從中國遼寧省大連市渤海海域采集海洋沉積物，并從 中分離得到一株對黃曲霉有高效抑菌作用的海藻希瓦氏菌株。申請人將其命名為海藻希瓦 氏菌YM8，Shewanella algae YM8,于2015年3月17日將該菌株送交中國.武漢.武漢大 學中國典型微生物保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏號為CCTCC NO :M 2015120。
[0008] 海藻希瓦氏菌（Shewanella algae) YM8的菌學特征：
[0009]海藻希瓦氏菌YM8革蘭氏染色為陰性，桿狀細菌，單端極生鞭毛，菌體大小為 0. 5ymX1.0ym~2. Oym(寬X長），生長溫度范圍為4-40°C，最適生長溫度為25-35°C。 [0010]我們對該菌株的16S rDNA進行了鑒定，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0:1所示。 [0011] 本發明還對該菌株對黃曲霉菌菌絲和孢子的高效抑制作用，新型揮發性代謝產物 鑒定與抑菌作用，對黃曲霉在不同溫度下的抑制作用以及對倉儲條件下花生、玉米黃曲霉 與毒素的抑制作用進行了相關研宄。
[0012] 本發明的有益效果是：
[0013] (1)本發明分離的海藻希瓦氏菌YM8為深海細菌，從海底沉積物中分離得到的一 種高效新型抑菌微生物，可作為生防菌株應用。
[0014] (2)本發明分離的海藻希瓦氏菌YM8首次證明在密閉環境下，可產生氣體物質具 有抑菌作用，可完全抑制黃曲霉菌絲的生長與孢子的萌發。
[0015] (3)本發明分離到的海藻希瓦氏菌YM8密閉空間內可以抑制病原真菌的生長，同 時可以抑制花生和玉米籽粒上的黃曲霉發病與毒素的合成。菌株YM8具有培養簡單，使用 方便，分布廣泛等優勢，應用前景廣泛。
[0016] (4)本發明得到的海藻希瓦氏菌YM8產生的揮發性物質具有抑菌作用，氣相色譜 質譜聯用儀檢測到15種物質，驗證了 6種主要物質對黃曲霉的抑制作用，證明兩種物質抑 菌效果明顯，可以作為潛在的殺菌劑開發應用。
[0017] (5)本發明得到的海藻希瓦氏菌YM8分離于深海，具有廣溫度適應性，在10-40°C 的溫度范圍內，可產生抑菌物質并抑制黃曲霉的生長。同時YM8具有廣譜抑菌性，可完全抑 制篩選的其他8種重要病原真菌的生長。
[0018] 更詳細的描述見《【具體實施方式】》。
【附圖說明】：
[0019] 序列表SEQ ID N0 :1是本發明分離的海藻希瓦氏菌YM8的16S rDNA的序列。
[0020] 圖1:海藻希瓦氏菌YM8在NA培養基上培養48h后的菌落形態。
[0021] 圖2:海藻希瓦氏菌YM8的掃描電鏡圖片。
[0022] 圖3 :海藻希瓦氏菌YM8菌株與其他近緣種菌株基于16s rDNA序列的系統發育樹。
[0023] 圖4:海藻希瓦氏菌YM8對黃曲霉菌的菌絲生長與孢子萌發的抑制作用。
[0024] 圖5:海藻希瓦氏菌YM8與黃曲霉孢子共培養10h，12h和24h后的孢子萌發形態。 圖5中的A，B，C圖分別為黃曲霉孢子單獨培養10, 12, 24h的形態；D，E，F圖分別為黃曲霉 孢子與YM8對扣培養10, 12, 24h后的狀態。
[0025] 圖6:添加活性炭對海藻希瓦氏菌YM8抑菌作用的影響。
[0026] 圖7:海藻希瓦氏菌YM8產生氣體物質的GC-MS檢測結果。圖7中標注的物質為 購買的豐度和相似度較高的六種物質的保留時間以及化學結構圖。
[0027] 圖8:海藻希瓦氏菌YM8對不同水活度條件下玉米與花生黃曲霉與毒素的控制。圖 8中A圖是不同水活度下的花生與玉米接種黃曲霉后培養7天后的發病圖片，圖8中的B圖 是7天后檢測不同水活度下籽粒中的黃曲霉毒素含量。
[0028] 圖9:水活度為0. 934下的花生培養7天后的掃描電鏡觀察。圖9中的"對照"是 花生接種黃曲霉孢子培養7天后的電鏡照片，圖9中的"YM8"是花生接種黃曲霉孢子與YM8 共培養7天后的電鏡照片。
[0029] 圖10:海藻希瓦氏菌YM8的廣譜抑菌作用。
[0030] 圖11:海藻希瓦氏菌YM8廣溫范圍內的抑菌活性檢測。
【具體實施方式】
[0031] 實施例1候選菌株YM8的分離和菌學鑒定
[0032] (1)候選菌株YM8的分離
[0033] 我們通過微生物學方法，從中國遼寧省大連市渤海海域采集海洋沉積物，并從中 分離得到一株對黃曲霉有高效抑菌作用的海藻希瓦氏菌株，我們將該候選菌株YM8編號 為。
[0034] (1)YM8菌株的形態特征鑒定
[0035] YM8 菌株于 NA培養基（牛肉膏 3.0g/L，蛋白胨 10.0g/L，NaCl 5.0g/L，瓊脂 15.0g/ L，補充蒸餾水至1L;調pH至7. 2)培養48h后